Функціональний аналіз бета-дефенсину-2 в злоякісно трансформованих клітинах

Краткое содержание

Матеріали та методи дослідження. Як експериментальні моделі в роботі використовували лінію клітин HEK293 та отримані з неї шляхом трансфекції сублінії HEKhBD-2Mat та HEKhBD-2Pr, що характеризуються експресією внутрішньоклітинної та секреторної форм hBD-2.

В експериментах in vivo використовували клітинну лінію 3LL та похідні від неї сублінії 3LLmBD-2, 3LLIgkmBD-2, 3LLpcDNA3, отримані шляхом трансфекції вихідної клітинної лінії векторами, що містять кДНК біологічно активної форми mBD-2, гібридну кДНК mBD-2 з лідерною послідовністю k-ланцюгу Ig миші та пустим вектором, відповідно.

Клітини культивували у середовищах DMEM або RPMI 1640, які містили 10% ембріональної сироватки великої рогатої худоби, 2 мМ L-глутаміну, 10 мкг/мл пеніциліну і 0,25 мкг/мл стрептоміцину при температурі 36,6^оС та 0,5% вологості. Для індукції експресії hBD-2 в клітинах HEKhBD-2Mat та HEKhBD-2Pr в середовище інкубації додавали тетрациклін в концентрації 10 мкг/мл.

Для визначення антимікробної активності отриманих пептидів використовували культури бактерій Bacillus subtilis АТСС 6633 та Pseudomonas aeruginosa АТСС 9027. Для трансформації, отримання плазмідних векторів та експресії білків використовувались наступні штами Escherichia coli: XLBlue, XLGold, TOP10, BL21DE, DH5a.

Для отримання фрагментів мРНК hBD-2 загальну РНК виділяли з лізатів клітин А431, інкубованих в присутності 0,25 нг/мл епідермального фактору росту протягом 9 годин, за модифікованим методом Хомчинськи (P. Chomczynski, 1987). Фрагменти мРНК mBD-2 отримували з лізатів макрофагів миші, індукованих ліпополісахаридами P. aeruginosa у концентрації 10 мкг/мл протягом 24 годин.

Для створення рекомбінантних форм hBD-2 та mBD-2 відповідні кДНК отримували методом ЗТ-ПЛР. Продукти ампліфікації та плазмідну ДНК розщеплювали відповідними ендонуклеазами. Очищені фрагменти ДНК лігували, використовуючи Т4 ДНК лігазу (“Fermentas”, Литва), згідно з протоколом виробника.

Фрагменти гена hBD-2, що кодують активний пептид та його непроцесовану форму, клонували у вектор pcDNA4neo, який представляє собою модифікацію комерційного вектора pcDNA4/TO з заміненою касетою зеоцину на неоміцинову та передбачає індуцибельну експресію цільового гена. Згідно послідовності мРНК було підібрано наступні праймери: прямий - 5`- ATT-AAG-CTT-TGA-AGC-TCC-CAG-CCA-TCA-G-3`, зворотній - 5`-ACC-GAA-TTC-ACG-TCT-CTG-ATG-AGG-GAG-CC-3` - для повної форми hBD-2; та прямий - 5`-GCC-AAG-CTT-ATT-ATG-GGT-ATA-GGC-GAT-CCT-GTT-ACC-3`, зворотній - 5`-TCT-TGG-AAT-TCT-CAT-GGC-TTT-TTG-CAG-CAT-TTT-G-3` - для активної форми hBD-2. Отримані генетичні конструкти та пустий вектор pcDNA4neo були введені в клітини лінії HEK293 у поєднанні з вектором pcDNA6/TR, що містить тетрацикліновий репресор транскрипції гену,  за допомогою метода ліпосомної трансфекції. Аналіз експресії дефенсину в створених сублініях (HEKpcDNA4neo, HEKhBD-2Mat HEKhBD-2Pr) проводили на рівні мРНК методом ЗТ-ПЛР, а на рівні білка методами імуноцитохімії та імуноферментного аналізу. Для контролю перебігу ЗТ-ПЛР та напівкількісного аналізу експресії гена hBD-2 використовували b-актин як «house-keeping» ген. Для ампліфікації цього гена використовували наступні олігонуклеотиди: прямий - 5`-Ccg-gaa-cgg-tga-agg-tga-ca-3`; зворотній - 5`- aag-gga-ctt-cct-gta-aca-atg-ca-3`, або праймери, підібрані на основі порівняння послідовностей генів b-актину людини та миші таким чином, що вони задовольняють умовам комплементарності обох генів: прямий - 5`-gaa-atc-gtg-ctg-gac-att-aa-3`; зворотній - 5`-caa-gac-agc-act-gtg-ttg-g-3`.

Імуноцитохімічні дослідження проводили з використанням авідин-біотинової системи (Dako, Данія). Для визначення експресії кіназ p70S6Ka, p70S6Kb та рівня фосфорилювання рибосомного білка S6 використовували метод Вестерн-блот аналізу.

Проліферативний потенціал клітин оцінювали по включенню ³[Н]-тимідину в ДНК клітин, які були синхронізовані пересіванням та культивовані у середовищі без сироватки в присутності або відсутності тетрацикліну протягом 18 годин. Клітини знімали розчином 0,25% трипсину, наносили на GF/C-фільтри та визначали включення мітки на рідинному сцинтиляційному лічильнику Intertechnique SL-30 (Франція). Оцінку туморогенності клітин проводили методом колонієутворення у напіврідкому середовищі. Колонії підраховували після двотижневої інкубації в середовищі DMEM, що містило 0,8% метилцелюлози, 30% ембріональної телячої сироватки та 1% альбуміну.

Рекомбінантний mBD-2 отримано шляхом клонування його кДНК у вектор pGEX-2Т. Згідно послідовності мРНК підібрано наступні праймери, що містили сайти рестрикції для ендонуклеаз BamHI та EcoRI, відповідно: прямий - 5`-ACC-GGA-TCC-ACC-ATG-GAA-CTT-GAC-CAC-TGC-CAC-ACC-3`; зворотній - 5`-GCC-GAA-TTC-TCA-TTT-CAT-GTA-CTT-GCA-ACA-GGG-3`. Аналіз експресії GST-злитого білка та добір умов культивування бактеріальної культури проводили згідно стандартному протоколу для GST системи експресії химерних білків (Novagene, США). Схема очищення рекомбінантного білка була розроблена на основі класичних хроматографічних методів.

Для дослідження біологічної дії mBD-2 було проведено клонування його кДНК у вектори pcDNA3.1+ та pSeqTag2a, перший з яких передбачає внутрішньоклітинну експресію цільового білка, а другий – його секрецію у середовище інкубації. Праймери для клонуваня були спроектовані згідно послідовності мРНК: прямі 5`-ACC-GGA-TCC-ACC-ATG-GAA-CTT-GAC-CAC-TGC-CAC-ACC-3` - для вектора pSeqTag2a та 5`-ACC-TAA-GCT-TCG-AAC-TTG-ACC-ACT-GCC-ACA-CC-3` - для вектора pcDNA3.1+. Зворотній праймер: 5`-GGC-GAA-TTC-TCA-TTT-CAT-GTA-CTT-GCA-ACA-GGG-3` – спільний для обох конструктів, містив стоп-кодон. Шляхом трансфекції клітинної лінії 3LL отриманими конструктами та пустим вектором були створені сублінії 3LLmBD-2, 3LLIgkmBD-2, 3LLpcDNA3, які відрізнялися по рівню експресії mBD-2, що контролювалося ЗТ-ПЛР. Проліферативні показники досліджуваних клітинних субліній оцінювали за рівнем включеного ³[Н]-тимідину в ДНК клітин, а їх туморогенну активність – за здатністю до колонієутворення в напіврідкому середовищі та за допомогою трансплантаційного тесту. Дослідження in vivo проводили згідно з правилами Європейської конвенції про захист хребетних тварин, що використовуються для дослідних та інших наукових цілей (Страсбург, 1986 p.) за наступною схемою: мишам 4-тижневого віку лінії С57Bl/6 (розводки віварію ІЕПОР ім. Р.Є. Кавецького НАН України) було трансплантовано 3х10⁵ клітин в 100 мкл фізіологічного розчину лінії 3LL та трансфектних клітин 3LLpcDNA3, 3LLmBD-2 і 3LLIgkmBD-2. В кожній групі було по 5 тварин. На 21 день після трансплантації пухлинних клітин визначали розмір та масу пухлин. Статистичну обробку даних проводили відповідно до загальноприйнятих методів. Для порівняння двох груп даних використовували двосторонній критерій Ст’юдента. Для визначення відносного рівня експресії бета-дефенсина-2, для напівкількісного аналізу, а також для підрахунку колоній використовували програму TotalLab v.2.01.

Результати досліджень та їх обговорення. Метою першого етапу роботи було отримання клітинних ліній, що експресують hBD-2 у процесованій та повній (непроцесованій) формах. Для виконнання цієї задачі була обрана T-Rex система, яка дозволяє регулювати експресію підпромоторного гена шляхом додавання тетрацикліну (Tet) у середовище інкубації.

Особливість цієї системи полягала в тому, що клітини лінії HEKhBD-2Mat експресували біологічно активну молекулу пептиду внутрішньоклітинно, тоді як в клітинах HEKhBD-2Pr була присутня непроцесована, тобто неактивна, молекула hBD-2, яка піддавалася протеолітичному розщепленню на мембрані клітини та секретувалася за її межі.

Принциповою перевагою такої модельної системи перед системою in vitro з застосуванням рекомбінантних пептидів, що використовується рядом дослідників, є те, що вона дозволяє отримати експресію дефенсину у низьких (фізіологічних) концентраціях, з одного боку, а з іншого – повністю виключити можливість неспецифічного впливу бактерійних артефактів, що супроводжують використання рекомбінантних білків, на показники росту та сигнальної трансдукції досліджуваних клітин.