Емельянов, Максим Олегович. Изучение влияния окислительного стресса на множественную лекарственную устойчивость опухолевых клеток

Краткое описание

Емельянов, Максим Олегович. Изучение влияния окислительного стресса на множественную лекарственную устойчивость опухолевых клеток : диссертация ... кандидата биологических наук : 03.01.04 / Емельянов Максим Олегович; [Место защиты: Ин-т фундаментальных проблем биологии РАН].- Пущино, 2011.- 122 с.: ил. РГБ ОД, 61 11-3/420

Учреждение Российской академии наук ИНСТИТУТ ТЕОРЕТИЧЕСКОЙ И ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ БИОФИЗИКИ РАН

Па правах рукописи

Емельянов Максим Олегович
Изучение влияния окислительного стресса на множественную лекарственную устойчивость опухолевых клетої^. |
Специальность 03.01.04 Биохимия
ДИССЕРТАЦИЯ
на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Научный руководитель д.б.н. Корыстов Ю.Н.
ПУЩИНО - 2011
Оглавление.
Введение 6
1. Обзор литературы 9
1.1. Окислительный стресс 9
1.1.1. Понятие окислительного стресса 9
1.1.2. Активные формы кислорода 10
1.1.2.1. Общее понятие активных форм кислорода 10
1.1.2.2. Супероксидный анион-радикал 11
1.1.2.3. Пергидроксильный радикал 13
1.1.2.4. Перекись водорода 13
1.1.2.5. Гидроксильный радикал 14
1.1.2.6. Синглетный кислород 15
1.1.2.7. Гипохлорид 16
1.1.2.8. Оксид азота 16
1.1.2.9. Пероксинитрит 17
1.1.3. Источники активных форм кислорода 17
1.1.3.1 Метаболические пути образования АФК 17
1.1.3.2. Образования АФК митохондриями во время гипоксии и гипероксии 24
1.1.3.3. Образования АФК при действии ионизирующего облучения ...26
1.1.4. Роль АФК 27
1.1.4.1. Клеточная сигнализация 27
1.1.4.2. Экспрессия генов 31
1.1.4.3. Регуляция клеточной гибели 32
1.1.4.4. Регуляция клеточного роста 33
1,2. Методы определения окислительного стресса в клетках 34
1.2.1. Определение супероксидного аниона-радикала 34
1.2.2. Детекция перекиси водорода 37
1.2.3. Детекция пероксинитрита 38
1.2.4. Использование флуоресцентного красителя 2’,7’- дихлорофлуоресцеина 39
1.3. Множественная лекарственная устойчивость 41
1.3.1. Неклеточные механизмы устойчивости 42
1.3.2. Клеточные формы устойчивости 43
1.3.3. Природная устойчивость 43
1.3.4. Приобретенная устойчивость 45
1.3.4.1. Роль ключевых генов, контролирующих апоптоз, в развитии лекарственной устойчивости 46
1.3.4.2. Транспортные белки, ответственные за множественную лекарственную устойчивость 49
1.3.4.2.1. Структура Р-гликопротеина 49
1.3.4.2.2. Конформационные изменения структуры P-gp 51
1.3.4.2.3. Субстратная специфичность P-gp 52
1.3.4.2.4. Ген mdrl, кодирующий Р-гликопротеин, генетические механизмы P-gp-МЛУ 53
1.3.4. '2.5. Экспрессия mdrl в нормальных тканях и клетках 55
1.3.4.2.6. Роль МЛУ, опосредованной P-gp, в злокачественных новообразованиях 56
1.3.4.2.7. MRP, белок, ассоциированный с множественной лекарственной устойчивости 57
1.3.4.2.8. Ингибиторы транспортных белков МЛУ 59
1.3.5. Регуляция МЛУ 60
1.3.5.1. Влияние цитокинов на МЛУ 61
1.3.5.2. Роль фосфолипазы С и протеинкиназы С в регуляции МЛУ 61
1.3.5.3. Роль МАРК каскада в МЛУ 63
1.3.5.4. Факторы транскрипции, регулирующие МЛУ 64
1.3.5.5. Влияние окислительного стресса на экспрессию генов и синтез белков, ответственных за МЛУ 65
2. Материалы и методы 70
2.1. Реактивы и среды 70
2.2 Определение количества клеток в опухоли 70
2.3. Облучение клеток 70
2.4. Культуры клеток. Определение выживаемости клеток 70
2.4.1. Клетки Р388 и P388VR. Определение влияния винкристина и перекиси водорода на выживаемость клеток 70
2.4.2. Клетки НЕр-2. Определение влияния винкристина и облучения на выживаемость клеток 72
2.5. Определение АФК 73
2.5.1. Определение АФК в клетках Р388 и P388VR 73
2.5.2. Определение АФК в клетках НЕр-2 74
2.6. Определение активности транспортных белков 75
2.6.1. В клетках НЕр-2 75
2.6.2. В клетках P388VR 77
2.7. Статистический анализ 79
3. Результаты 80
3.1. Разработка нового метода определения АФК по количеству образовавшегося в клетках DCF 80
3.2. Определение АФК в клетках в различных условиях 85
3.2.1. Влияние на АФК в клетках in vitro состава среды, концентрации клеток, перекиси водорода 85
3.2.2 Влияние ионизирующей радиации на АФК в клетках 87
3.3. Влияние окислительного стресса на МЛУ клеток лимфолейкоза P388VR 91
3.3.1. Изменение МЛУ при росте клеток in vivo 92
3.3.2. Влияние перекиси водорода на МЛУ 93
3.4. Влияние ионизирующей радиации на МЛУ клеток НЕр-2 95
3.4.1. Влияние радиации на МЛУ. Зависимость от дозы, концентрации
клеток и времени после облучения 95
4. Заключение 101
4.1. Разработка нового метода определения АФК по количеству образовавшегося в клетках DCF 101
4.2. Влияние на АФК ионизирующей радиации 101
4.3. Роль АФК в изменении МЛУ опухолевых клеток 102
4.4. Значение полученных результатов для терапии опухолей 103
5. Выводы 105
Список цитируемых источников 106
Введение.
По данным Всемирной Организации Здравоохранения онкологические заболевания являются одной из самых распространенных причин смерти на Земле. Несмотря на многолетние изучения проблемы рака, терапия онкологических заболеваний сталкивается с рядом трудностей, одной из которых является множественная лекарственная устойчивость опухолевых клеток к различным противоопухолевым препаратам.
Устойчивость к лекарственным препаратам может развиваться вследствие блока в опухолевых клетках апоптоза, вследствие особенности роста опухоли, при которых уменьшается кровоснабжение опухоли, и следовательно, доставка препаратов с кровью. МЛУ также может быть результатом инактивации препарата в клетке, снижения его поступления в клетку и повышения вывода препарата из нее. В последнее время показано, что множественная лекарственная устойчивость опухолевых клеток, обусловленная откачкой из клеток противоопухолевых препаратов транспортными белками, является одним из главных факторов снижающих эффективность химиотерапии опухолей. Поэтому изучение регуляции экспрессии и активности транспортных белков в опухолевых клетках важно для химиотерапии опухолей.
В последние десятилетия возросло внимание ученых к изучению эффектов активных форм кислорода. В качестве месенжеров они влияют на такие клеточные процессы как клеточная гибель, старение, пролиферация, экспрессия генов, множественная лекарственная устойчивость. Относительно последнего имеется большой ряд работ, посвященных эффекту активных форм кислорода на синтез транспортных белков, ответственных за множественную лекарственную устойчивость. Причем этот эффект носит довольно противоречивый характер: в одних случаях окислительный стресс стимулирует МЛУ за счет синтеза новых белков, в других - подавляет, а в третьих - не оказывает влияния вовсе. Скорее всего, противоречивость эффектов связана с различиями в типах клеток, генах, которые экспрессируют разные белки, в концентрациях АФК. Все это в совокупности дает разные результаты в экспериментах о влиянии АФК на МЛУ. Одной из наших задач было посмотреть влияние ионизирующего облучения как модулятора АФК на множественную лекарственную устойчивость на уровне синтеза транспортных белков, отвечающих за МЛУ.
При большом количестве работ о влиянии АФК на синтез транспортных белков, ответственных за МЛУ, нами не было обнаружено статей о влиянии окислительного стресса на активность самих транспортных белков. Поэтому одной из задач данного исследования было оценить влияние окислительного стресса на активность белка P-gp, обеспечивающего множественную лекарственную устойчивость клеток мышиного лимфолейкоза P388VR мышей.
Параллельно с увеличением внимания к изучению эффектов АФК появилось большое количество методов количественного определения АФК как в клетке, так и в растворе. Довольно часто используется флуоресцентный краситель, который начинает светиться после взаимодействия с окислителем (АФК). Одним из таких красителей является 2’,7’-дихлорфлуоресцин. В методах определения АФК пользуются его предшественником 2’,7’- дихлорофлуоресцин диацетатом, который, после попадания в клетку, посредством внутриклеточных эстераз теряет две ацетатные группы, приобретает заряд и таким образом “запирается” в клетке. Появившийся в клетке 2’,7’-дихлорфлуоресцин в реакции с АФК становиться 2’,7’- дихлорфлуоресцеином, который флуоресцирует и определяется спектрофлуориметрически или микроскопически. Главная проблема использования этого детектора - его неустойчивость, что сказывается на точности результатов. 2’,7’-дихлорофлуоресцин диацетат при нейтральном pH способен спонтанно гидролизоваться, а 2’,7’-дихлорфлуоресцин спонтанно окисляться. По этому еще одной задачей настоящей работы явилась адаптация использования DCF для измерения окислительного стресса в клетках.
Задачи исследования:
1. Разработать метод определения АФК в клетках с использованием 2’,7’-дихлорофлуоресцин диацетата и определить АФК в клетках в норме и при действии окислительного стресса различной природы (радиация, перекись водорода).
2. Изучить влияние ионизирующего облучения на МЛУ клеток рака гортани человека НЕр-2.
3. Изучить влияние окислительного стресса на активность белка Р- gp и МЛУ клеток P388VR мышиного лимфолейкоза.

Список литературы

Выводы:
0. Разработан новый метод определения окислительного стресса в клетках с помощью DCFH2-DA, свободный от артефактов, присущих микроскопическому варианту метода. Этим методом измерено количество АФК в клетках в норме и при воздействии перекиси водорода и радиации.
1. Показано, что немедленным эффектом окислительного стресса является подавление активности транспортных белков и повышение чувствительности клеток к противоопухолевым препаратам.
2. Показано, что отсроченным эффектом ионизирующей радиации может быть увеличение активности транспортных белков и устойчивости клеток к противоопухолевым препаратам.
Список цитируемых источников.
• Болдырев А.А. Окислительный стресс и мозг. 2001, 4, 21-28.
• Ермакова Н.В., Шапошникова В.В., Левитман М.Х., Ким Ю.А., Корыстов Ю.Н. Изменение множественной лекарственной устойчивости клеток лимфолейкоза Р388, устойчивых к винкристину, при росте асцитной опухоли // Биол. мембраны. 2004. Т. 21. № 2. С. 102-106.
• Ермакова Н.В. Исследование модификации множественной лекарственной устойчивости опухолевых клеток. 2005. Пущино.
• Корыстов Ю.Н., Ермакова Н.В., Шапошникова В.В., Левитман М.Х., Ким Ю.А., Пушкин С.Ю. Введение перфторана в асцитную опухоль мвшиного лимфолейкоза снижает количество клеток и уменьшает их множественную лекарственную устойчивость. Биологические мембраны. 2006. V.23. №1. 22-26.
• Скулачев В.П. Кислород в живой клетке: добро и зло. 1996, СОЖ, 3, 4- 10.
• Ставровская А.А. Клеточные механизмы множественной лекарственной устойчивости опухолевых клеток. Биохимия. 2000, 65, 112-126.
• Хавинсон В.Х., Баринов В.А., Артюнян А.В., Малинин В.В. Свободнорадикальное окисление и старение. - СПб : Наука, 2003. - 327.
• Ярлин А.А. Основы иммунологии. Медицина. 1999.
• Ярмоненко, С.П. Радиобиология человека и животных. - М.: Высш. шк., 2004. с. 50-51.
• Adams J.M., Cory S. The Bcl-2 Protein Family: Arbiters of Cell Survival. Science, Aug 1998; 281: 1322 - 1326.
• al-Mehdi A., Shuman H., Fisher A.B. Fluorescence microtopography of oxidative stress in lung ischemia-reperfusion. Lab Invest, Apr 1994; 70(4): 579-87.
• Altuvia S., Stein W.D., Goldenberg S., Kane S.E., Pastan I., Gottesman M.M. Targeted disruption of the mouse mdr lb gene reveals that steroid hormones enhance mdr gene expression. J. Biol. Chem., Dec 1993; 268: 27127-27132.
• Alvarez S., Valdez L.B., Zaobomyj Т., Boveris A. Oxygen dependence of mitochondrial nitiic oxide synthase activity. Biochem Biophys Res Commun, Jun 2003; 305(3): 771-5.
• Ambudkar S.V., Dey S., Hrycyna C.A., Ramachandra М., Pastan I., Gottesman M.M. Biochemical, cellular, and pharmacological aspects of the multidrug transporter. Annu Rev Pharmacol Toxicol, Jan 1999; 39: 361-98.
• Babior BM. Phagocytes and oxidative stress. Am J Med; 2000; 109 (1): 33- 44.
• Babior BM. The NADPH oxidase of endothelial cells. IUBMB Life; 2000; 50 (4-5); 267-9.
• Bakos E., Evers R., Sinko E., Varadi A., Borst P., Sarkadi B. Interactions of the Human Multidrug Resistance Proteins MRP1 and MRP2 with Organic Anions. Mol. Pharmacol., Apr 2000; 57: 760.
• Barford D. The role of cysteine residues as redox-sensitive regulatory switches. Curr Opin Struct Biol, Dec 2004; 14(6): 679-86.
• Bedard K. and Krause K-H. The NOX Family of ROS-Generating NADPH Oxidases: Physiology and Pathophysiology. Physiol Rev.; 2007; 87: 245- 313.
• Benov L., Sztejnberg L., Fridovich. Critical evaluation of the use of hydroethidine as a measure of superoxide anion radical. Free Radic Biol Med, Nov 1998; 25(7): 826-31.
• Biedler J.L., Reihm H. Cellular Resistence to Actinomycine D in Chinase Hamster Cells in Vitro: Cross-Resistance, Radioautographic, and Cytogenetic Studies. 1970, Cancer Res., 30, 1174-1179.
• Bindokas V.P., Jordan J., Lee C.C., and MillerRJ. Superoxide production in rat hippocampal neurons: selective imaging with hydroethidine. J. Neurosci., Feb 1996; 16: 1324.
• Bolduc J.-S., Denizeau F., Jumarie C. Cadmium-Induced Mitochondrial Membrane-Potential Dissipation Does Not Necessarily Require Cytosolic Oxidative Stress: Studies Using Rhodamine-123 Fluorescence Unquenching. Toxicol. Sci, Feb 2004; 77: 299 - 306.
• Borst P., Evers R., Kool М., Wijnholds J. The multidrug resistance protein family. Biochim Biophys Acta, Dec 1999; 1461(2): 347-57.
• Borst P., Evers R., Kool М., Wijnholds J. A Family of Drug Transporters: the Multidrug Resistance-Associated Proteins. J Natl Cancer Inst, Aug 2000; 92: 1295 - 1302.
• Borbat P.P., Costa-Filho A.J., Earle K.A., Moscicki J.K., Freed J.H. Electron Spin Resonance in Studies of Membranes and Proteins. Science, Jan 2001; 291: 266.
• Boveris A., Martino E., Stoppani A.O. Evaluation of the horseradish peroxidase-scopoletin method for the measurement of hydrogen peroxide formation in biological systems. Anal Biochem, May 1977; 80(1): 145-58.
• Boveris A. Determination of the production of superoxide radicals and hydrogen peroxide in mitochondria. Methods Enzymol, Jan 1984; 105: 429- 35.
• Cadenas B, Davies KJ. Mitochondrial free radical generation, oxidative stress, and aging. Free Radic. Biol. Med. 2000. 29; 222 - 230.
• Carter W.O., Narayanan P.K., and Robinson J.P. Intracellular hydrogen peroxide and superoxide anion detection in endothelial cells. J. Leukoc. Biol., Feb 1994; 55: 253 - 258.