Экспериментальное обоснование повышения эффективности хирургического лечения тонкокишечной непроходимости путем активации местных пептидергических систем Коваленко Алексей Анатольевич

Краткое описание

Коваленко Алексей Анатольевич. Экспериментальное обоснование повышения эффективности хирургического лечения тонкокишечной непроходимости путем активации местных пептидергических систем: диссертация ... кандидата Медицинских наук: 14.01.17 / Коваленко Алексей Анатольевич;[Место защиты: ФГАОУ ВО Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова Министерства здравоохранения Российской Федерации (Сеченовский Университет)], 2019
Экспериментальное обоснование повышения эффективности хирургического лечения тонкокишечной непроходимости путем активации местных пептидергических систем Коваленко Алексей Анатольевич
ОГЛАВЛЕНИЕ ДИССЕРТАЦИИ
кандидат наук Коваленко Алексей Анатольевич
ВВЕДЕНИЕ

1 СОВРЕМЕННЫЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЯ О ПАТОГЕНЕЗЕ КИШЕЧНОЙ НЕПРОХОДИМОСТИ И ПЕПТИДЕРГИЧЕСКОЙ РЕГУЛЯЦИИ ФУНКЦИЙ КИШЕЧНИКА (ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР)

1.1 Острая кишечная непроходимость: этиология и патогенез

1.2 Роль гемодинамики и лимфоциркуляции в патогенезе формирования кишечной непроходимости

1.3 Структурно-функциональная организация системы опиоид-ной регуляции функций ЖКТ

1.4 Эндогенные пептиды - регуляторы функций ЖКТ

1.5 Пептидергическая регуляция функции ЖКТ при патологических состояниях

1.6 Защитные эндогенные пептиды - ключевой фактор регуляции гомеостаза кишечной стенки

1.7 Современные представления о пептидергической регуляции лимфатических сосудов

2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1 Дизайн исследования

2.2 Этические и нормативные процедуры при проведении исследования

2.3 Основные сведения о лабораторных животных

2.4 Характеристика объекта исследования

2.5 Моделирование кишечной непроходимости (КН) у крыс.... 47 2.5.1 Создание энтеро-энтероанастомоза (ЭЭА)

2.6 Биомикроскопия брыжейки и стенки ТК крысы

2.6.1 Регистрация сокращения стенки и клапана лимфатических

микрососудов (ЛМ) брыжейки ТК крысы

2.7 Лазерная допплеровская флоуметрия (ЛДФ) стенки ТК крысы

2.8 Методы оценки восстановления структуры и функции кишки после проведения хирургического вмешательства и использования пептида-171

2.9 Статистическая обработка результатов исследования

3 ВЫЖИВАЕМОСТЬ КРЫС С РАЗЛИЧНЫМИ МОДЕЛЯМИ

ТОНКОКИШЕЧНОЙ НЕПРОХОДИМОСТИ

3.1 Сравнительный анализ выживаемости животных при различных видах экспериментальной тонкокишечной непроходимости и введении опиоидного пептида

3.2 Изучение влияния возрастных и гендерных факторов на выживаемость животных при экспериментальной тонкокишечной непроходимости и введении опиоидного пептида

4 МИКРОЦИРКУЛЯЦИЯ В БРЫЖЕЙКЕ И СТЕНКЕ ТК КРЫСЫ В ДИНАМИКЕ ХИРУРГИЧЕСКОГО РАЗРЕШЕНИЯ КИШЕЧНОЙ НЕПРОХОДИМОСТИ (КН) И ПРИ ВВЕДЕНИИ ПЕПТИДА

4.1 Динамика показателя микроциркуляции (ПМ) стенки ТК

крыс с различными моделями ТКН (по данным ЛДФ)

4.2 Биомикроскопическое изучение реакции кровеносных и лимфатических сосудов при ТКН в контроле и при введении пептида

4.2.1 Реакция элементов венозного русла брыжейки ТК при КН

в контроле и при введении пептида

4.2.2 Реакция лимфатических микрососудов брыжейки ТК крысы при КН в контроле и при введении пептида

5 ИЗУЧЕНИЕ РОЛИ ЛИМФОСТИМУЛИРУЮЩЕГО ПЕПТИДА В ВОССТАНОВЛЕНИИ СТРУКТУРЫ КИШЕЧНОЙ СТЕНКИ ПОСЛЕ ЕЕ РЕЗЕКЦИИ И НАЛОЖЕНИЯ МЕЖКИШЕЧНОГО АНАСТОМОЗА ПО ПОВОДУ ТОНКОКИШЕЧНОЙ НЕПРО-

ХОДИМОСТИ

6 ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Список литературы

Острая кишечная непроходимость: этиология и патогенез
Универсальность патогенеза и клинических проявлений, единые подходы в диагностике и лечении патологического состояния, связанного с нарушением пассажа кишечного содержимого в аборальном направлении (от желудка к прямой кишке), в настоящее время рассматривается как полиэтиологическое состояние, именуемое КН, и как самостоятельная нозологическая единица [13, 4, 14, 15].
Этиологические факторы кишечной непроходимости принято разделять на предрасполагающие (как правило, механические изменения брюшной стенки, связочного аппарата брюшной полости, брыжейки или стенки кишки, инородные тела в просвете кишки) и производящие (чаще функциональные расстройства моторики) [21,22].
Первая группа включает в себя врожденные и приобретенные состояния. К врожденным относятся разного рода особенности и аномалии анатомического строения кишки и кишечной стенки: удлинение участков кишки (мегаколон, долихосигма), незавершенность поворота кишечника, врожденные стенозы и окклюзии кишечника, пороки развития нервно-мышечного аппарата кишки [23]. К приобретенным факторам следует отнести спаечный процесс в брюшной полости, развивающийся после хирургических вмешательств и воспалительных заболеваний органов брюшной полости, приобретенные наружные и внутренние грыжи, новообразования, обтурация просвета желчными камнями, фитобезоарами, каловыми камнями, гельминтами [24,25].
Производящие факторы — резкое увеличение двигательной активности кишечника вследствие повышенной пищевой нагрузки (особенно после голодания), медикаментозной стимуляции, повышения внутрибрюшного давления при тяжелой физической нагрузке, развития энтероколита.
Доказана роль нерегулярного, несбалансированного и недостаточного питания в развитии КН [26,27].
Первая научно-обоснованная классификация острой кишечной непроходимости была предложена в XVII в. Ранхиным, разделившим все виды ОКН на вызванные закупоркой кишки изнутри (obturatio) и сдавлением кишки извне (compressio). В 1948 г А.Г. Соловьев сформулировал классификацию ОКН, имеющую много общего с современной. В дальнейшем она неоднократно модифицировалась различными авторами, однако принципиальное деление ОКН на механические и динамические формы неизменно сохранялось [28].
В настоящее время наиболее важным в тактическом плане является разделение больных на три формы заболевания: странгуляционную, обтура-ционную и мезентериальную [11,29]. Нецелесообразно отдельно выделять так называемую смешанную форму, которая имеет признаки как странгуля-ционной, так и обтурационной непроходимости. Это вносит неопределенность как в терминологическом, так и в тактическом плане, не позволяя обеспечить своевременное лечение пациентов.
1. Обтурация нарушение пассажа по различным отделам кишечника без нарушения кровоснабжения органа. Чаще всего причиной такой формы являются спайки брюшной полости, желчные камни, безоары.
2. Странгуляция нарушение кровоснабжения кишки в месте на рушения пассажа, встречается при спайках брюшной полости, инвагинации, завороте и узлообразовании.
3. Мезентериальная форма непроходимости (вследствие нарушения артериального притока и или венозного оттока по сосудам брыжейки без странгуляции) выделяется не всеми авторами.
В динамике развития болезни различают три фазы (стадии) (табл. 1.1).
Патофизиологическая основа 3-й стадии формирование на фоне обезвоживания трех источников эндотоксикоза. Вследствие развития симбиотно-го пищеварения и изменения градиента аллохтонной флоры в дистально-проксимальном направлении, накопления жидкости и газов в приводящем отделе кишки формируется внутрикишечный первый источник интоксикации. Вторым источником интоксикации является стенка кишки, из тканей которой в кровеносное русло поступают лизосомальные ферменты, оказывающие повреждающее действие, которые определяют различной степени выраженности изменения со стороны всех органов и систем. В этой стадии происходит быстрое инфицирование первоначально геморрагического экссудата в брюшинной полости, развитие гнойного перитонита третьего источника интоксикации.
В зависимости от уровня локализации патологического фактора, вызывающего КН, выделяют тонкокишечную (частота встречаемости 60-70%) и толстокишечную (частота 30-40%) непроходимость [30,31].
Острая тонкокишечная непроходимость (ОТКН) является распространенным острым хирургическим заболеванием,[32-37] и среди всех хирургических больных, поступающих в стационары с острой болью в животе, составляет до 20% [1,38-42]. Летальный исход наблюдается у 10,564,2% больных и за последние годы не имеет тенденции к снижению [39, 43]. К сожалению, несмотря на распространение новых медицинских технологий в медицинскую практику, ОТКН остается тяжелым и опасным заболеванием [44, 45, 32, 46, 47], а при развитии перитонита или токсико-септического шока летальность достигает 70100% [48-52].
Причиной ОТКН чаще от 50 до 75% случаев бывают послеоперационные спайки брюшной полости [53-57]. Это обусловлено ростом количества хирургических вмешательств на органах брюшной полости и результативного лечения перитонитов различной этиологии, а также иных гнойно-воспалительных заболеваний брюшной полости, при которых спайки развиваются в 6397% случаев [57, 59]. Более 30% пациентов, перенесших хирургические вмешательства на органах брюшной полости, госпитализируются повторно для лечения спаечной болезни и ее осложнений, и примерно у 20% из них ведущей причиной является ОТКН [58].
Опухолевые поражения кишки, особенно у лиц пожилого и старческого возраста, являются причиной кишечной непроходимости. В подавляющем большинстве случаев острая кишечная непроходимость является осложнением колоректального рака, которое возникает у 1520% больных [60-65]. В этой возрастной группе старше 50 лет опухоли толстой кишки имеют осложненное течение в 42,586,2% случаев [66, 67].
По данным [67, 68], наиболее часто непроходимость толстой кишки встречается у лиц пожилого и старческого возраста (55%). Обтурационная непроходимость в два раза чаще развивается при раке левой половины ободочной кишки, чем её правой половины [69]. При одной и той же форме КН показатели летальности могут быть различны. Факторы, увеличивающие смертность при КН, следующие: длительность болезни, время обращения за медицинской помощью от начала заболевания, возраст больного, наличие сопутствующих заболеваний и их декомпенсация, а также объем выполненного оперативного вмешательства [70, 71, 72]. Хирургия острой кишечной непроходимости сопряжена с высоким уровнем летальности, достигающим 25%, частым развитием послеоперационных осложнений [73]. Диагностика спаечной КН часто вызывает сложности, что является причиной задержки операции, и поэтому приводит к увеличению частоты послеоперационных осложнений, а также летальности.
Причинами острой тонкокишечной непроходимости (ОТКН), по данным научной литературы, также могут быть инвагинации, гематомы стенки кишки, болезнь Крона, первичные новообразования стенки ТК, патология мезентеральных сосудов, энтериты на фоне лучевой терапии, миграция желчных камней в просвет ТК, безоары, дистальный интестинальный об-структивный синдром, инородные тела ТК, эндометриоз, внутрибрюшные спайки, грыжи живота как брюшной стенки, так и внутренние [74].
Защитные эндогенные пептиды ключевой фактор регуляции гомеостаза кишечной стенки
Защитные эндогенные пептиды представлены полипептидными молекулами, синтезируемыми клетками слизистой оболочки кишечника, которые обладают широким спектром биологических эффектов (рис. 1.3). Важнейшими семействами пептидов, найденными у большинства позвоночных животных и человека, являются дефенсины, кателицидины, S100 семейство, суперсемейство рибонуклеаз А, регенерирующих лектинов С-типа (REGIII) и пеп-тидогликан-распознающие пептидов [142]. Дифенсины, на основе последовательности из шести цистеинов, подразделяются на три подсемейства: альфа-, бета- и гамма-дефенсины. Если бета-подсемейство идентифицировано у всех позвоночных, а альфа у большинства видов, то гамма-дефенсины найдены лишь у приматов [142]. Кателицидины идентифицированы по кателиновому домену [143]. S100 семейство пептидов обладают сайтом связывания для ионов кальция [144, 145]. Супер-семейство рибонуклеаз А характеризуется наличием 6-8 цистеиновых последовательностей, формирующих характерные дисульфидные мостики с постоянно локализованными остатками гистидина и лизина [146, 147].
REGIII семейство представлено водорастворимыми С-лектинами с кар-богидратным доменом, связывающимся с сахарами по кальций-зависимому типу [148]. Наконец, пептидогликан-распознающие пептиды способны связываться с пептидогликаном микробной клетки посредством специфического взаимодействия с мирамил-трипептидным фрагментом [149].
Система защитных эндогенных пептидов с природной противомикроб-ной активностью в отношении Грам-положительных и Грам-отрицательных бактерий, вирусов, грибов, простейших и даже опухолевых клеток является составной частью местного иммунитета [150, 151]. Человеческие LL-37, альфа и бета-дефенсины обладают наиболее широкой противомикробной активностью [150, 151]. Для кателицидинов была показана высокая активность в отношении бактерий, в том числе антибиотико-резистентных штаммов [152, 153, 154-156]. Бета-дефенсины активны в отношении возбудителей зоонозов [157-159].
Механизм противомикробного действия пептидов обусловлен разрушением клеточной стенки микроорганизмов или взаимодействием с внутриклеточными макромолекулами [160]. В силу сложного механизма реализации активности пептидов многие микроорганизмы довольно чувствительны к ним, однако в последнее время развитие кишечных инфекций связывают непосредственно с формированием пептидной резистентности микроорганизмов, которая, однако, не распространяется на индуцированные формы пептидов 161, 162].
Помимо антимикробной активности, рассматриваемый класс пептидов участвует в реализации местных иммунных реакций [163, 164] (рис. 1.3). Многие человеческие пептиды способны активировать миграцию нейтрофи-лов или моноцитов и подавлять провоспалительный ответ. Также человеческие эндогенные пептиды обладают выраженными свойствами по стимуляции дифференцировки макрофагов и дендритных клеток. Кроме того, человеческие кателицидины LL-37 индуцируют разрешение воспалительного процесса путем активации реэпителизации и ранозаживления, а также ауто-фагии и апоптоза [163, 164]. Указанные эффекты реализуются за счет прямого связывания с липополисахаридами (ЛПС) микробных клеток и ингибиро-вания ЛПС-опосредованной продукции цитокинов в макрофагах и активации воспалительной реакции [154-156].
Дефенсины, в том числе и человеческие, обладают свойствами хемотаксиса в отношении незрелых дендритных клеток моноцитарного происхождения [165]. Кателицидин PR-39 способен подавлять НАДФН-оксидазную активность фагоцитов и ослаблять ишемически-реперфузионное повреждение кишечной стенки [166] путем блокирования энзиматического ансамбля за счет связывания с р47phox цитозольным компонентом НАДФН-оксидазы [167]. Пептид ускоряет заживление ран в связи с индукцией синдеканов [168], активирует ангиогенез и формирование функциональных кровеносных сосудов посредством ингибирования убиквитин-протеосомно-зависимой деградации фактора, индуцирующего гипоксию 1-альфа (HIF 1-а) [169].
В последние годы появляется все больше доказательств участия защитных эндогенных пептидов в регуляции проницаемости слизистого барьера кишечника посредством прямого участия в экспрессии муцина [170-186] и пептидов, обеспечивающих формирование клеточных контактов в эпителиальном слое слизистой оболочки кишки (рис. 1.4).
Эпителий толстой кишки представлен однослойным призматическим эпителием, формирующим крипты и кишечные ворсины. Клеточный состав кишечного эпителия включает стволовые клетки, энтероциты, секреторные клетки (клетки Панета, бокаловидные и эндокринные клетки) [187]. При этом основными продуцентами эндогенных пептидов являются бокаловидные клетки и клетки Панета. Латеральные мембраны всех клеточных элементов кишечного эпителия образуют три вида контактов: плотные контакты, адгезивные соединения и десмосомы [189, 190, 191], формирующие совокупно виртуально непроницаемый барьер. Помимо барьерной функции, указанные контакты принимают участие в поддержании поляризации клетки. Рассматриваемые контакты (рис. 1.6) представляют собой мультипротеиновые ком плексы, состоящие из трансмембранных, цитоплазматических белков, взаимодействующих непосредственно с цитоскелетом. Среди перечисленных видов соединений лишь плотные контакты обладают селективной проницаемостью для воды, электролитов и некоторых других молекул низкой молекулярной массы [189, 190, 191].
Среди множества протеинов, вовлеченных в формирование межклеточных соединений, наибольшее структурно-функциональное значение имеют трансмембранные клаудины, окклюдины, молекулы адгезии (МА) и три-целлюлин, а также цитозольные zonula occludens (ZO) и цингулин [189, 190, 191]. Среди позвоночных структура указанных белков имеет высокую степень структурного консерватизма [192-198].
Структурная организация ключевых участников плотных межклеточных контактов была детально изучена на основе кристаллической модели мышиного клаудина-15 с использованием методов электронной и спиновой микроскопии в перекрестных экспериментах (рис. 1.5). Было установлено, что белковые структуры образуют сложные конфигурации, включающие мембранные и цитозольные домены и петли, устроенные таким образом, чтобы были возможны конформационные изменения макромолекул, обеспечивающие широкий спектр сайтов связывания, а также регуляции проницаемости соединений [191, 192, 199, 200].
Кишечный барьер позволяет обеспечивать гомеостаз между кишечной микробиотой и иммунной системой хозяина. Дисфункция межклеточных соединений обусловливает развитие целого ряда патологических состояний кишечника, среди которых следует упомянуть болезнь Крона, неспецифический язвенный колит, целиакия и др. [189, 191]. Так, установлено, что при болезни Крона снижается экспрессия клаудинов 3, 5 и 8, окклюдина и молекул адгезии 1 типа наряду с существенным ростом экспрессии клаудина-2. У пациентов, страдающих НЯК, наблюдается гипорегуляция клаудинов-1 и 4, молекул адгезии 1 типа на фоне гиперэкспрессии клаудина-2 [189, 191]. При обоих патологических процессах установлена гиперэкспрессия MLCK (сайт связывания с легкими цепями миозина) [201].