Оценка эффективности различных методов диагностики инфекции вируса лейкоза крупного рогатого скота Двоеглазов, Николай Геннадьевич

Краткое описание

Двоеглазов Николай Геннадьевич. Оценка эффективности различных методов диагностики инфекции вируса лейкоза крупного рогатого скота : диссертация ... кандидата ветеринарных наук : 16.00.03 / Двоеглазов Николай Геннадьевич; [Место защиты: Ин-т эксперим. ветеринар. Сибири и Дал. Востока].- Новосибирск, 2009.- 126 с.: ил. РГБ ОД, 61 09-16/58
ОГЛАВЛЕНИЕ ДИССЕРТАЦИИкандидат ветеринарных наук Двоеглазов, Николай Геннадьевич
Введение.
1. Обзор литературы.
1.1. Структурная, морфологическая, генотипическая и иммунологическая характеристика ВЛКРС.
1.2. Методы диагностики лейкоза крупного рогатого скота.
1.2.1. Серологические методы диагностики.
1.2.1.1. Реакция иммунодиффузии в геле агара.
1.2.1.2. Иммуноферментный анализ, как альтернатива РИД.
1.2.1.3. Иммуноблотинг.
1.2.1.4. Причины выпадения серологических реакций.
1.2.2. Молекулярные методы диагностики.
1.2.2.1. Полимеразная цепная реакция.
1.2.2.2. Способы оптимизации и особенности проведения ПЦР.

Список литературы

Введение к работе
Актуальность проблемы. Распространение ВЛКРС представляет угрозу скотоводству во всем мире. С внедрением в 70-х годах прошлого столетия в диагностику лейкоза КРС серологических методов было установлено, что степень распространения инфекции и количество инфицированного крупного рогатого скота намного выше, чем предполагалось ранее. В последнее время, все больше поступает сообщений о вновь выявленных очагах его распространения в тех странах, где раньше его не регистрировали. На сегодня известно, что ЛКРС распространен более чем в трети всех стран мира (R.F. DiGiacomo, 1992; W. Wittmarm, 1993; J.L.F. Cordeiro et al, 1994; H.T. Kaura and O.J.B. Hubschle, 1994; K. Losieczka and S. Klimentowski, 1994; J. Meszaros et al., 1994; E.H. Birgel et al., 1995; R.M. Jacobs et al, 1995; A. Kurdi et al., 1999; S. Meas et al., 2000, 2002; K.G. Trono et al., 2001; A. Zaghawa et al., 2002).
Ретроспективный анализ по числу неблагополучных пунктов и количеству выявленных больных животных по Российской Федерации за сорокалетний период (1966-2003 гг.) показал, что в структуре инфекционной патологии крупного рогатого скота на лейкоз приходится 57% от всех инфекционных болезней. Представленные данные свидетельствуют об усилении эпизоотической напряженности по лейкозу как в целом по стране, так и большинству территорий. Количество вновь объявленных неблагополучных пунктов, превышает число оздоровленных. К числу наиболее неблагополучных субъектов следует отнести Ростовскую, Волгоградскую, Воронежскую, Саратовскую, Псковскую области, Краснодарский, Ставропольский края, Республику Марий Эл и другие территории, где уровень зараженности крупного рогатого скота вирусом лейкоза составляет от 20 до 45 %. В отдельных хозяйствах, среди взрослых животных, инфицированность ВЛКРС превышает 80 и более процентов.
Вместе с тем, анализируя сведения о проведенных лабораторных исследованиях на лейкоз, можно сделать вывод, что официальные статистические сведения по лейкозу в ряде субъектов являются явно заниженными и не отражают истинных масштабов распространения, как заболеваемости, так и инфицированности животных ВЛКРС. Полученные данные свидетельствуют о том, что при примерно одинаковом количестве гематологических исследований за 1991-2003 гг. по РФ выявлено значительно больше больных животных (133,4 тыс.) при этом процент выявленных больных животных увеличился с 1,8% до 2,64%, а уровень зараженности ВЛКРС за этот же период практически не изменился и составил соответственно 14,2 и 13,1% (В.А. Апалькин и соавт., 2005).
Каждый год появляется все больше сообщений о новых особенностях течения лейкозной инфекции, ее этиологическом агенте (ВЛКРС). Например, стало известно, что некоторые телята, рожденные от инфицированных коров, являются толерантными к ВЛКРС и не синтезируют антитела, оставаясь при этом источником инфекции (В.А. Крикун, 2002). Расширяется и набор методологических средств применяемых для изучения лейкоза.
Используемая сегодня в России, и ряде других стран для серологической диагностики РИД не отвечает современному уровню знаний о ЛКРС. При неоспоримой простоте постановки реакции, она значительно уступает в чувствительности другим, более современным методам, например, таким как ИФА и иммуноблотинг (О.А. Верховский и соавт., 2002; K.G. Trono et al., 2001). Невозможность автоматизации делает РИД не удобной при массовых исследованиях и вносит долю субъективизма в оценку результатов.
Однако все животные-вирусоносители не могут быть выявлены ни одним из серологических методов. Это связано с тем, что они регистрируют только ответную иммунологическую реакцию организма на патологического агента в форме наработки антител, в то время как некоторые инфицированные животные имеют слишком низкие для детекции титры антител или не синтезируют их совсем. Также, содержание антител в крови может меняться в зависимости от физиологического состояния. Такие животные, в дальнейшем, могут служить источником новых вспышек инфекции в оздоровленных стадах (М.И. Гулюкин и соавт., 2002; В.А. Крикун, 2002; D. Beier et al., 1998).
В подобных случаях актуальным является примененение генномолекулярных методов диагностики, таких как молекулярная гибридизация и ПЦР. ПЦР позволяет выявлять, по разным данным, на 10-42% больше инфицированных ВЛКРС животных, чем РИД или ИФА (Н.В. Кузнецова и соавт., 1997; Л.Б. Прохватилова и соавт., 1998; В.А. Бусол и соавт., 1999; Н.Т. Джапаралиев и соавт., 2000; В.А. Апалькин и соавт., 2005; К.В. Mullis et al., 1986; Н.М. Naif et al., 1990; A. Popov et al., 1993; H. Poon et al., 1993; H. Fechner et al., 1996a; U. Czarnik et al., 2000; S.E. Gutierrez et al., 2001; M. Rola and J. Kuzmak, 2002; D.W. Nagy et al., 2003; C.J. Kuckleburg et al, 2003). Также, при помощи ПЦР возможно отличить инфицированных телят от телят с колостральными антителами (A. Agresti et al., 1993; F.W. Eaves al., 1994).
Однако в связи с тем, что все перечисленные методы имеют недостатки, актуальными являются исследования по оптимизации регламента для каждого метода в системе оздоровительно-профилактических мероприятий при лейкозе.
Обобщая сведения о распространении лейкоза в нашей стране, а также данные лабораторных исследований следует сделать вывод, что в целом продолжает иметь место негативная динамика усиления напряженности по лейкозу, а во многих субъектах РФ лейкоз приобрел характер эпизоотии. Это требует принятия более радикальных и эффективных мер борьбы с лейкозом, принятие специальной государственной программы и внесения дополнений в существующие «Правила по профилактике и борьбе с лейкозом» 1999 года (В.А. Апалькин и соавт., 2005).
Цель работы: провести сравнительное изучение эффективности существующих методов диагностики ВЛКРС-инфекции (РИД, ИФА и ПЦР) и оптимизировать регламент их применения в системе оздоровления крупного рогатого скота от лейкоза.
Задачи исследований:1. Провести сравнительный анализ диагностической эффективности методов РИД и ИФА в сопоставлении с результатами ПЦР на крупном рогатом скоте неблагополучных по лейкозу хозяйств.
2. Оптимизировать регламент применения методов РИД, ИФА и ПНР в системе оздоровления крупного рогатого скота от лейкоза.
Научная новизна работы. Установлено, что относительное содержание антител к ВЛКРС в сыворотке крови коров выше, чем у молодняка крупного рогатого скота. Так, у взрослых животных этот показатель, по результатам ИФА, составил 42,29 о.е. (для отрицательных в РИД), 75,46 о.е. (для слабоположительных в РИД, титр антител от 1:1 до 1:4) и 85,45 о.е. (для положительных в РИД, титр антител свыше 1:8), у телок случного возраста-35,59 о.е., 49,23 о.е. и 78,25 о.е. соответственно.
Проведенный на репрезентативном поголовье сравнительный анализ эффективности методов РИД, ИФА и ПЦР при диагностике ВЛКРСинфекции показал, что ни один из этих методов не позволяет полностью выявить всех животных-вирусоносителей. Так эффективность РИД составила76,1%, ИФА - 83,3%, ПЦР - от 58,3 до 72,6%.
Научно обоснован регламент использования ИФА и ПЦР в хозяйствах с разной эпизоотической ситуацией по ВЛКРС-инфекции.
Практическое значение работы. Инструментальный вариант учета результатов ИФА в сопоставлении с визуальным, позволяет дополнительно выявлять до 2% инфицированных животных, так как пробы сыворотки крови, дающие сигнал менее 30 о.е. при инструментальном учете, при визуальном оцениваются как сомнительные.
Предложен вариант применения ИФА в системе общепринятых методов диагностики инфекции ВЛКРС, который предусматривает регламент исследований животных в зависимости от напряженности эпизоотической ситуации по лейкозу. С целью рационального использования ИФА рекомендуется применять данный тест при первичном разделении неблагополучного стада и на завершающей стадии оздоровления.
Оптимизирован регламент применения тест-систем РИД, ИФА и ПЦР при диагностике ВЛКРС-инфекции.
Результаты исследований использованы при разработке методических рекомендаций.
Основные положения, выносимые на защиту:1. Результаты сравнительного изучения эффективности тест-систем РИД и ИФА в сопоставлении с ПЦР при диагностике ВЛКРС-инфекции.
2. Оптимизированный регламент применения РИД, ИФА и ПЦР в системе оздоровительно-профилактических мероприятий при ВЛКРСинфекции.
Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на заседаниях ученого совета ГНУ ИЭВСиДВ СО Россельхозакадемии (2002-2004 гг.); научно-практической конференции, посвященной 70-летию Иркутской НИВС (Иркутск, 2002); международной научно-практической конференции «Современные проблемы эпизоотологии» (Новосибирск, 2004); международной научно-практической конференции «Актуальные вопросы ветеринарной медицины» (Новосибирск, 2005); Сибирской Межрегиональной научно-практической конференции (Новосибирск, 2008).
Публикации. По теме диссертации опубликованы 8 научных работ, в том числе одна - в журнале «Сибирский вестник сельскохозяйственной науки», рекомендованном ВАК РФ. Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 125 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения результатов исследований, выводов, практических предложений, списка литературы и приложения. Работа иллюстрирована 15 таблицами и 4 рисунками. Список использованной литературы включает 245 источников.
Структурная, морфологическая, генотипическая и иммунологическая характеристика ВЛКРС
Этиологическим агентом бычьего лейкоза является вирус, получивший название "вирус лейкоза крупного рогатого скота" (ВЛКРС), или Bovine Leukemia virus (BLV). Это экзогенный онковирус, относящийся к семейству Retroviridae, подсемейству Oncornaviridae, роду Deltaretroviras. Вместе с вирусом Т-клеточного лейкоза человека (HTLV), ВЛКРС относится к особой группе, обозначенной типом Е (Л.Г. Бурба и А.А. Кунаков, 1983; В.А. Сергеев и Б.Г. Орлянкин, 1983; П.Н. Смирнов и соавт., 1992; В.Н. Сюрин и соавт., 1998; В.Ю. Луговцев и Д.А. Васильев, 2002; J.M. Miller etal., 1969).
После связывания со специфическими рецепторами клеточной мембраны ВЛКРС проникает внутрь путем эндоцитоза. Затем с помощью обратной транскриптазы на геномной РНК синтезируется ДНК вируса, которая интегрирует в ДНК клетки, образуя провирус. ВЛКРС не имеет предпочтительных сайтов интеграции в хромосомах. Инфицированные клетки содержат от одной до четырех копий провируса. Последний по многим характеристикам ведет себя как нормальный ген клетки, который передается ее потомству. Интеграция является необходимым условием для репликации вируса. Для обеспечения репликации ВЛКРС необходимо всего три гена: gag, рої и env. Из интегрированного провируса транскрибируются копии вирусной РНК и м-РНК; последние транслируются в белки. При достаточном количестве геномных РНК и необходимых вирусных белков образуются вирусные частицы (вирионы), которые затем освобождаются из клетки путем почкования, и жизненный цикл ретровируса замыкается (П.Н. Смирнов и соавт., 1992; Е.В. Гусева и Т.А. Сатина, 2000; Б.Г. Орлянкин и соавт., 2000; В.Ю. Луговцев и Д.А. Васильев, 2002; R. Kettmann et al., 1980, 1982; J. Deschamps et al., 1981; M. Onuma et al., 1982).
Структура и геном ВЛКРС Впервые морфологию ВЛКРС достоверно описал в 1969 году J.M. Miller в ультратонких срезах лимфоцитов больной лейкозом коровы, стимулированных фитогемагглютинином, при краткосрочном их культивировании. Электронно-микроскопическими исследованиями краткосрочных культур лимфоцитов от ВЛКРС-инфицированного крупного рогатого скота, а также персистентно инфицированных клеточных культур было установлено, что вирусные частицы имеют сферическую форму. Внешняя вирусная оболочка представлена 2-контурной мембраной, которая лабильна, из-за чего диаметр вирионов может сильно варьировать - от 73 до 120 нм. На ее поверхности расположены шипики (пепломеры) с пуговкообразным утолщением на конце, длиной 8-11 нм, которые состоят из субъединиц, образованных двумя гликозилированными вирусными белками gp51 и gp30, отвечающими за типоспецифичность. Зрелые вирионы ВЛКРС содержат центральнорасположенный электронно-плотный нуклеоид, диаметр которого варьирует от 40 до 90 нм. Центральная часть нуклеоида отделена от внешней вирусной оболочки промежуточным слоем (Л.Г. Бурба и А.А. Кунаков, 1983; В.А. Сергеев и Б.Г. Орлянкин, 1983; В.Н. Сюрин и соавт., 1998; Б.Г. Орлянкин и соавт., 2000; В.Ю. Луговцев и Д.А. Васильев, 2002; J. Calafat et al., 1974). Гексагональное очертание нуклеоида в ультратонких срезах позволяет предполагать икосаэдрическую симметрию. В нуклеокапсиде РНК находится в виде спирализованного рибонуклеопротеина. Две одноцепочные (60-70S) плюс-РНК, соединенные водородными связями в области 5 —концов, связаны с внутренними структурными протеинами р12 и р15, и совместно с р10 и р24 образуют ядро (В.А. Сергеев и Б.Г. Орлянкин, 1983; Е.В. Гусева и Т.А. Сатина, 2000; O.R. Kaaden et al., 1977; О. Hruskova-Heidingsfeldova, 1995).
Геном вируса может существовать в 2-х формах: геномной 1-цепочечной РНК или в виде ДНК, синтезированной на геномной РНК как на матрице, и интегрированной в хромосому клетки-хозяина в виде провируса. Геномная РНК содержится только в зрелых вирионах. В жизненном цикле вируса геномная РНК функционирует лишь 1 раз, когда служит матрицей для фермента - обратной транскриптазы при биосинтезе комплементарной ДНК. Весь объем биохимических процессов, необходимый для полной репликации вируса, выполняется с участием ДНК-провируса (В .А. Сергеев и Б.Г. Орлянкин, 1983; В.Н. Сюрин и соавт., 1998; В.А. Бусол и соавт., 1999; J. Ghysdael et al., 1978, 1979; J. Deschamps et al., 1981).
N. Sagata et al. (1985) описали полную нуклеотидную последовательность ВЛКРС, изолированного от крупного рогатого скота с лимфосаркомой в 1983 г. (N. Sagata et al., 1983). Согласно N. Sagata et al. (1985) геном ВЛКРС состоит из 8714 нуклеотидов. Он имеет следующую структуру: 5 LTR-gag-prt-pol-env-X-3 LTR (N.R. Rice et al., 1984, 1985; N. Sagata et al., 1985; J. Coulston et al., 1990; S. Alexandersen et al., 1993).