Білюк Анастасія Анатоліївна Оцінка протипухлинних, анти-метастатичних та біохіміч­них показників новосинтезованих п,п-хелатних комплек­сів Pd2+ та Pt2+ з N-алілтіосечовинами

Краткое описание

Білюк Анастасія Анатоліївна, тимчасово не працює: «Оцінка протипухлинних, анти-метастатичних та біохіміч­них показників новосинтезованих п,п-хелатних комплек­сів Pd2+ та Pt2+ з N-алілтіосечовинами» (03.00.04 - біо­хімія). Спецрада Д 26.001.24 у Київському національному університеті імені Тараса Шевченка

Київський національний університет імені Тараса Шевченка
Міністерство освіти і науки України
Київський національний університет імені Тараса Шевченка
Міністерство освіти і науки України
Кваліфікаційна наукова
праця на правах рукопису
БІЛЮК АНАСТАСІЯ АНАТОЛІЇВНА
УДК 577.112.7;612.115
ДИСЕРТАЦІЯ
ОЦІНКА ПРОТИПУХЛИННИХ, АНТИ-МЕТАСТАТИЧНИХ ТА
БІОХІМІЧНИХ ПОКАЗНИКІВ НОВОСИНТЕЗОВАНИХ n, πХЕЛАТНИХ КОМПЛЕКСІВ Pd2+ТА Pt
2+
З N-АЛІЛТІОСЕЧОВИНАМИ
03.00.04-біохімія
Подається на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

Дисертація містить результати власних досліджень. Використання ідей,
результатів і текстів інших авторів мають посилання на відповідне джерело
____________А. А. Білюк
Науковий керівник: д.б.н., Гарманчук Людмила Василівна
Київ – 2017

ЗМІСТ
Перелік умовних позначень, символів, одиниць, скорочень і термінів 16
Вступ 18
РОЗДІЛ 1 Метаболічні дисфункції пухлинних клітин та шляхи їх
нормалізації 25
1.1 Метаболічне перепрограмування пухлинних клітин та основні
ферменти у формуванні медикаментозної резистентності 25
1.2 Функціональна активність мітохондрій в нормі та за патології 27
1.3 Роль мітохондрій за пухлинного росту 32
1.4 Протипухлинні препарати на основі платино- та паладієвмісних
комплексів 36
1.5 Доклінічні схеми визначення ефективності новостворених потенційно
значимих терапевтичних засобів 41
РОЗДІЛ 2 Матераали та методи дослідження 48
2.1 Матеріали та обладнання 48
2.2 Об’єкти досліджень 50
2.3 Клітинні лінії 51
2.4 Отримання первинної культури із перещепленої карциноми легені
Льюїс 52
2.5 Модель пухлинного росту 53
2.6 Отримання сироватки крові від тварин 57
2.7 Отримання мітохондрій та внутрішніх мембран мітохондрій з пухлинної
тканини 57
2.8 Визначення концентрації білка 58
2.9 Метод визначення сукцинатдегідрогеназної активності у гомогенаті 59
2.10 Метод визначення сукцинатдегідрогеназної активності у культурі
клітин 60
2.11 Метод визначення цитохромоксидозної активності 61
2.12 Визначення активності аланінамінотрансферази (КФ 2.6.1.2) 62
14
2.13 Визначення активності аспартатамінотрансферази (КФ 2.6.1.1) 62
2.14 Визначення активності лактатдегідрогенази ( КФ 1.1.1.27) 63
2.15 Визначення активності гаммаглутамінтранспептидази (КФ 2.3.2.2) 63
2.16 Глюкозооксидазний тест для визначення концентрації глюкози
середовищі інкубації 64
2.17 Метод отримання багатоклітинних сфероїдів культури клітин раку
молочної залози – MCF-7 з використанням карбоксиметил-целюлози 65
2.18 Метод підрахунку клітин в сфероїдах 66
2.19 Цитотоксичний/цитостатичний тест 67
2.20 Вимірювання рівня апоптозу, вмісту анеуплоїдних та диплоїдних клітин
та розподілу клітин за фазами циклу 67
2.21 Визначення адгезивних властивостей культивованих клітин за впливу
новосинтезованих сполук 69
2.22 Статистична обробка результатів 69
РОЗДІЛ 3 Оцінка цитотоксичної/цитостатичної та проапоптотичної дії
новосинтезованих n,π-хелатних комплексів Pd2+ та Pt2+
з n-алілтіосечовинами 70
РОЗДІЛ 4 Визначення ГГТ-активності в клітинах HepG2 за дії n,π-хелатних
комплексів Pd2+та Pt2+
з N-алілтіосечовинами 79
РОЗДІЛ 5 Визначення впливу новосинтезованих координаційних
n, π-хелатних комплексів Pd
2+ та Pt
2+ З N-алілтіосечовинами на ростові та
біохімічні характеристики багатоклітинних сфероїдів пухлинних клітин раку
молочної залози MCF-7 85
РОЗДІЛ. 6. Визначення протипухлинних анти-метастатичних та
метаболічних показників за дії новосинтезованих сполук платини в системі
in vivo 96
6.1 Визначення протипухлинної та анти-метастатичної дії цисплатину та
комплексів ІІ та ІV 96
15
6.2 Визначення активності цитохром оксидази та сукцинатдегідрогенази на
первинній культурі LLC 100
Аналіз результатів дослідження 109
Висновки 122
Список використаних джерел 124
16
ПЕРЕЛІК УМОВНИХ ПОЗНАЧЕНЬ, СИМВОЛІВ, ОДИНИЦЬ,
СКОРОЧЕНЬ І ТЕРМІНІВ
АлАТ аланінамінотрансфераза
АНТ аденіннуклеотидтранслоказа
АсАТ аспартатамінотрансфераза
АДФ аденозіндифосфат
АТФ аденозінтрифосфат
ВММ внутрішньої мембрани мітохондрій
ГГТ гамаглутамілтранспептидаза
ДНК дезоксирибонуклеїнова кислота
ЛДГ лактатдегідрогеназа
ПМ плазмотична мембрана
ПОЛ перекисного окиснення ліпідів
СДГ сукцинатдегідрогеназа
ЦО цитохромоксидаза
ЦТК цикл трикарбованих кислот
ЕПР ендоплазматичний ретикулюм
ЕТЛ електронтранспортного ланцюга
IFCC міжнародна спілка клінічної хімії
HIF-1 hypoxia-inducible factor-1
Hela карциноми шийки матки
Hep G2, Гепатокарцинома
GLUT білки транспортери глюкози
LLC карцинома легені Льюїс
MCF-7 рак молочної залози людини
MRP множинна терапевтична резистентність
17
МТТ 3-(4,5-диметилтіазол-2-іл)-2,5-дифенілтетразолію
бромід
NADH нікотинамідаденіндинуклеотид
РІЗК phosphoinositide-3-kinase
ROS активні формами кисню
PTEN phosphatase and tensin homologue
VDAC voltage-dependent anion channel
18
ВСТУП
Актуальність теми. Пошук нових ефективних препаратів в лікуванні
новоутворень є актуальним до сьогодні у зв’язку з набуттям нечутливості
пухлинних клітин до існуючих в даний час лікарських засобів [1, 2]. Зміна
біологічних властивостей пухлинних клітин обумовлена різними
причинами, в тому числі біохімічною анаплазією та метаболічним
перепрограмуванням [2-6]; яке у пухлинних клітинах включає декілька
аспектів. Так, згідно теорії Варбурга, основним є анаеробний гліколіз та
гостра метаболічна модифікація через депривацію глюкози і суттєве
пригнічення тканинного дихання [2,7]. Ця дисфункція, викликана
зниженою активністю мітохондріальних ферментів в умовах гіпоксії, що
призводить до гальмування електрон-транспортного ланцюга [8],
накопичення лактату та пригнічення апоптичного сигналінгу [9-11].
Мутації генів деяких мітохондріальних білків, зокрема
сукцинатдегідрогенази (СДГ), індукують розвиток дисфункцій циклу
трикарбованих кислот (ЦТК) та можуть бути не лише наслідком, а й
причиною утворення пухлин. З 1985 року одним із маркерних ферментів
при виникненні опірності пухлин виділяють гамаглутамілтранспептидазу
(ГГТ), яка шляхом зв’язування з глутатіоном призводить до зниження
біодоступності лікарських препаратів [12]. Серед класичних
протипухлинних препаратів особливе місце займають препарати
платинової групи. Першим препаратом, впровадженим в клінічну практику
в 1971 р. був препарат цис-дихлордиамінплатина (II) (цисплатин), який
займає провідне місце в лікуванні ряду солідних пухлин. Однак,
використання цисплатину часто обмежене наявністю побічних ефектів,
таких як нефротоксичність, нейротоксичність, міелосупрессія, втрата слуху,
нудота тощо [13-19] та природної (характерної для деяких видів раку,
наприклад, товстої кишки, передміхурової залози, легені чи молочної
залози), або набутої під час терапії опірності пухлин. Для подолання такої
19
побічної дії постійно триває пошук і клінічні випробування більш активних
та менш токсичних препаратів на основі сполук платини та інших
перехідних металів, зокрема паладію.
В хімічному аспекті, подолання побічних ефектів до цисплатину
можна досягти, використовуючи молекулярний ефект "антисимбіозу" у
транс-впливі, який описав Пірсон Р. у 1963 році. Для цього в ролі лігандів
при синтезі аналогів цисплатину було застосовано N-алілзаміщені похідні
тіосечовини. Вони належать до хелатних лігандів з «м'якими» (за
класифікацією Пірсона) донорними групами, які мають високий рівень
транс-впливу якості "лігандів-носіїв" [21-24]. Це може знизити
спорідненість новосинтезованих сполук платини та паладію до "м'яких"
атомів сірки тіоловмісними молекулами, що, як наслідок, може запобігати
їх зв'язуванню з тіольними групами в плазмі крові та транспортуватись до
ДНК проліферуючих клітин - їх основної фармацевтичної мішені.
Тож, для доведення ефективності новосинтезованих n,π-хелатних
комплексів Pt2+та Pd
2+ з N-алілтіосечовинами [23, 24], [Pd(HL1
)Cl2] (I),
[Pt(HL1
)Cl2] (II), [Pd(HL2
)Cl2](III), [Pt(HL2
)Cl2] (IV), синтезованих в реакції
[PtCl4]
2– або [PdCl4]
2– аніонів з HL1–2 в водно-спиртовому розчині в
присутності HCl є оцінка не лише безпосередніх показників їх
протипухлинної дії, таких як апоптичні, цитотоксичні, анти-метастатичні та
антиінвазивні, а й біохімічних показників, які в пухлинних клітинах
пов’язані з мітохондріальними та метаболічними порушеннями.
Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами.
Дисертаційну роботу виконано на кафедрії біохімії ННЦ «Інститут біології
та медицини» Київського національного університету імені Тараса
Шевченка у рамках бюджетних тем «Механізми реалізації адаптаційно –
компенсаторних реакцій організму за умови розвитку різних патологій» (№
д/р 0111U004648, 2011 – 2015 рр), «Механізми регуляції метаболічних
процесів в організмі за умов розвитку патологічних станів» (№ д/р
0111U004648, 2016-2018 рр.), бюджетної теми «Альтернативні моделі для
20
тестування клітинних препаратів на онкогенність» відділення цільової
підготовки Київського національного університету імені Тараса Шевченка
при НАН України (№ д/р 0116U005183, 2016 р), бюджетної теми Інституту
високих технологій «Синтез флуоресцентних, флуоровмісних,
фоточутливих та конформаційно утруднених амінокислот та налагодження
біологічних тестів (№ д/р 0114U003471, 2016-2017 рр.)
Мета та завдання дослідження. Метою роботи була оцінка
антипроліферативних, проапоптичних ефектів та активності ключових
ферментів метаболізму за дії новосинтезованих сполук n,π-хелатних
комплексів Pd2+та Pt2+ з N-алілтіосечовинами на пухлинні клітини in vitro та
in vivo.
Для досягнення поставленої мети необхідно було вирішити такі основні
задачі:
1. На моделі пухлинних клітин лінії Hela у порівняльному аналізі з
цисплатином оцінити цитотоксичний/ цитостатичний та проапоптичний
ефект новосинтезованих n,π-хелатних комплексів Pd2+та Pt2+ з Nалілтіосечовинами.
2. Визначити рівень ГГТ - активності в клітинах гепатоцитарного
походження клітинах лінії HepG2 за дії новосинтезованих сполук.
3. Провести порівняльне дослідження протипухлинної анти-метастатичної
та метаболічної ефективності новосинтезованих сполук n,π-хелатних
комплексів Pd2+та Pt2+ з N-алілтіосечовинами на моделі сфероїдного росту
пухлинних клітин MCF-7.
4. Охарактеризувати біологічні властивості пухлинних клітин та
цитохромоксидазну і сукцинатдегідрогеназну активність в
мітохондріальних мембранах пухлини мишей з перещепленою
карциномою легені Льюїс на різних етапах росту та метастазування
5. Визначити протипухлині, анти-метастатичні та метаболічні показники
за дії новоинтезованих n,π-хелатних комплексів Pd2+та Pt2+ з Nалілтіосечовинами на моделі перещеплюваної карциноми легені Льюїс.
21
Об’єкт дослідження – функціонування ферментів енергетичного обміну
(ЦО, СДГ, ЛДГ), апоптичнні, проліферативні показники пухлинних клітин
під впливом новосинтезованих n,π-хелатних комплексів Pd2+та Pt2+ з Nалілтіосечовинами.
Предмет дослідження – ферментативна активність ключових ферментів
метаболізму за умов впливу n,π-хелатних комплексів Pd2+та Pt2+ з Nалілтіосечовинами на показники росту та метастазування пухлинних
клітин.
Методи дослідження – у роботі використано спектрофотометричне
визначення активності ряду ферментів та їх метаболітів,
цитофлуориметричний аналіз рівня анеуплоїдних, диплоїдних,
апоптотичних клітин та розподілу за фазами циклу під впливом n,πхелатних комплексів Pd2+та Pt2+ з N-алілтіосечовинами, оцінка
ефективності останніх як протипухлинних, анти-метастатичних та
метаболічних засобів за їх впливу на пухлинні культивовані клітини та
перещеплювану модель високометастатичної карциноми легені Льюїс в
системі in vivo.
Наукова новизна одержаних результатів. Вперше охарактеризовано
біологічну активність новосинтезованих n,π-хелатних комплексів Pd2+та
Pt2+ з N-алілтіосечовинами за такими параметрами як протипухлинні, антиметастатичні та метаболічні показники в системах in vitro та in vivo з
використанням трансформованих клітин з різним фенотипом. Встановлено,
що морфоліновий гетероцикл в якості ліганда в n,π-хелатному Pt2+
комплексі є найбільш ефективним засобом щодо пригнічення ГГТактивності, а також стимулятором активності ферментів ЦТК таких, як СДГ
та цитохромоксидаза (ЦО). Також за дії даного комплексу виявлено
пригнічення лактат ацидозу в мікрооточенні пухлинних клітин. На
системному та клітинному рівні спостерігається нормалізація вмісту
глюкози в сироватці крові та зниження темпів її утилізації пухлинними
клітинами із середовища культивування. Даний вплив новосинтезованих
22
n,π-хелатних комплексів Pd2+та Pt2+ з N-алілтіосечовинами свідчить на
користь нормалізації метаболічних показників.
Практичне значення одержаних результатів. Використання
багатофункціональної системи із набору різних пухлинних клітин, маркерні
молекули яких вказують на прогресію/регресію пухлиноасоційованих
показників для скринінгу нових потенційно значимих терапевтичних
засобів на основі класичного препарату цисплатину, розширюють
можливість доклінічних досліджень з метою пошуку більш ефективних
протипухлинних засобів та менш токсичних сполук для нормальних
тканин.
Отримані результати фундаментальних досліджень дії n,π-хелатних
комплексів Pd2+та Pt2+ з N-алілтіосечовинами як засобів, що пригнічують
пухлинний ріст, метастазування та нормалізують біохімічний фенотип
пухлинних клітин, можуть розглядатись як основа для створення
фармакологічних форм на основі новосинтезованих платиновмісних засобів
в протипухлинній терапії.
Особистий внесок здобувача. Дисертаційна робота є самостійною
науковою працею. Здобувачем здійснено пошук фахової літератури згідно
теми дослідження, аналіз сучасного стану проблеми, проведення
експериментальних досліджень, обробка та теоретичне обґрунтування
результатів. Постановка завдань, розробка схеми досліджень, узагальнення
результатів та формулювання висновків здійснено спільно з науковим
керівником. N-алілзаміщені похідні тіосечовини як ліганди було надано
к.х.н., ст.н.с. Зборовським Ю.Л. та к.х.н., ст.н.с. Орисик В.В. (Інститут
органічної хімії НАН України), n,π-комплекси Pt(II) та Pd(II) синтезовано
к.х.н. Репіч Г.Г. та д.х.н., ст.н.с. Орисик С.І. (Інститут загальної та
неорганічної хімії ім. В.І. Вернадського НАНУ); ідеї щодо хімічних
аспектів подолання резистентності сполук сформульовано співавторами
робіт к.х.н., м.н.с. Репіч Г.Г., д.х.н., ст.н.с. Орисик С.І., к.х.н., ст.н.с.
Зборовським Ю.Л. та к.х.н., ст.н.с. Орисик В.В., член-кореспондентом
23
НАНУ Пехньо В.І., д.х.н., Вовком М.В. Апоптоз, клітинний цикл
проаналізовано в НДЛ експериментальної онкології Національного
інституту раку (завідувач д.б.н. Н.М. Храновська)
Апробація результатів дисертації. Результати експериментальних
досліджень представлені та апробовані на 15th World Congress on
Gastrointestinal Cancer (Spain, Barcelona, 2013); конференції молодих учених
"Актуальні проблеми біохімії та біотехнології (Інститут біохімії ім. О. В.
Палладіна НАНУ, Україна, Київ, 2014 р.); First EFIS-EJI Caucasian School in
Allergy and Immunology (Georgia, Tbilisi, 2016); IX International scientific
conference for students and PhD students "Youth and progress of Biology"
(Ukraine, Lviv, 2013); I Міжнародній науковій конференції "Тиждень
клітинних технологій" (Україна, Kиїв, 2013); 4
th European Congress of
Immunology (Austria, Vienna, 2015); 1 EFIS-EJI Caucasian School in Allergy
and Immunology (Georgia, Tbilisi, 2016); II International scientific conference
"Microbiology and Immunology-the development outlook in the 21st century",
(Ukraine, Kyiv, 2016) XV International Conference of. Students and Young
Scientists "Shevchenkivska Vesna: BioScience Advances" (Ukraine, Kyiv,
2016); ІІІ Всеукраїнській науково-практичній конференції "Об’єднані
наукою:перспективи міждисциплінарних досліджень" (Україна, Київ, 2016);
на International Conference on Coordination and Bioinorganic Chemistry
Modern trends in coordination, bioinorganic, and applied inorganic chemistry
(Slovakia, Smolenice, 2017); ІІІ міжнародній біомедичній школі для
студентів, аспірантів та молодих учених "Клітинні функції у нормі та при
паталогії" (Київ, Україна, 2017).
Публікації. За результатами досліджень опубліковано 17 наукових праць,
з яких 6 наукових статей у фахових виданнях, що відповідають вимогам
МОН України, з них 1 – в журналі, що індексуються міжнародною
наукометричною базою даних Scopus, а також 11 матеріалів і тез доповідей
на всеукраїнських та міжнародних наукових конференціях.
24
Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота викладена на
147 сторінках, з яких 123 основного тексту, складається із вступу, огляду
літератури, матеріалів і методів досліджень, 4 розділів результатів власних
досліджень із обговоренням; аналізу та узагальнення результатів
досліджень, висновків, списку використаної літератури (187 посилань, з
яких 172 латиницею, 15 кирилицею).
Висновок біоетичної експертизи. Згідно з висновком комісії з питань
біоетики ННЦ «Інститут біології та медицини» Київського національного
університету імені Тараса Шевченка (протоколу № 5 від 29 листопада 2017
р.) експериментальні дослідження не суперечать загально прийнятим
біоетичним нормам з дотриманням відповідних міжнародних положень
стосовно проведення експериментальних робіт та клінічних досліджень.
Дослідження виконано відповідно до вимог Хельсінської декларації
(Всесвітня медична асамблея, 1964), Міжнародних принципів Європейської
конвенції про захист хребетних тварин, що використовуються для
дослідних та інших наукових цілей (Страсбург, 1986), Декларації принципів
толерантності (28 сесія ЮНЕСКО, 1995), Універсальної декларації по
біоетиці та правах людини (ООН, 1997), норм Конвенції про захист прав
людини у зв’язку з впровадженням нових біомедичних технологій,
прийнятою у 1997 році у м. Ов’єдо (Іспанія) та відповідно до Закону
України № 3447 ІV “Про захист тварин від жорстокого поводження” .

Список литературы

ВИСНОВКИ
Вперше охарактеризовано біологічну активність новосинтезованих n,πхелатних комплексів Pd2+та Pt2+з N-алілтіосечовинами (комплекси І- ІV):
виявлено пригнічення росту та метастазування пухлин та доведено
модифікуючий вплив на метаболізм пухлинних клітин Pt2+комплексу ІІ, де в
якості ліганду приєднано морфоліновий гетероцикл, за такими параметрами як
пригнічення ГГТ- та ЛДГ-активності, зниження лактоацидозу, а також
стимуляція активації ключових мітохондріальних ферментів - СДГ та ЦО.
1. При порівняльному аналізі дії новосинтезованих комплексів на пухлинні
клітини Hela виявлено, що показник ІС50 для цисплатину мав такий порядок як
комплекс ІІ та ІV (5,7х10-5 М, 1,0х10-5 М та 2,5х10-5 М, відповідно), тоді як
комплекс І мав показник на порядок вищий (1,5х10-4 М), а ІІІ на порядок
нижчий (2,0х10-6 М).
2. Зменшення вмісту пухлинних клітин в S-фазі спостерігалось для клітин
під дією як цисплатину, так і всіх досліджуваних комплексів, порівняно з
контролем - найнижчий показник був характерний за впливу комплексу ІІ;
накопичення в G2/M фазі корелювало зі збільшенням апоптозу, рівень якого
для цисплатину перебільшував відповідний в контролі в 3 рази, для комплексу
ІІ в 5.5 разів, для ІІІ – майже в 3 рази та ІУ –в 3,7 разів, відповідно.
3. З використанням клітин гепатоцитарного походження HepG2 доведено,
що морфоліновий гетероцикл в якості ліганда в n,π-хелатному Pt2+ комплексі ІІ
є найбільш ефективним засобом пригнічення ГГТ-активності, яка знижується в
1,2 та 1,4 рази порівняно з контролем та цисплатином, відповідно.
4. Морфогенез клітин MCF-7 в 3D структурах залежав від терміну
інкубування з комплексами та цисплатином. Найбільш виражені зміни за дії
досліджуваних сполук були зафіксовані у віддалені терміни культивуваннякомплекси I та II проявили стимулюючий ефект на розміри сфероїдів,
комплекс IV не впливав на цей параметр, а цисплатин та комплекс III чинили
пригнічувальний вплив на ріст сфероїдів. Всі досліджувані комплекси
123
проявили цитотоксичний/цитостатичний ефект на сфероїди з розміром, що
характеризують метастатичний пул. ГГТ-активність в кондиційованому
середовищі сфероїдів під впливом комплексів І-ІV пригнічувалась на відміну
від дії цисплатину та в контролі.
5. Порівняльний аналіз впливу цисплатину з платиновими комплексами ІІ та
ІV на системному рівні продемонстрував пригнічення росту та метастазування
карциноми легені Льюїс, що характеризувалось зниженням темпів росту та
об’єму первинної пухлини: за введення комплексу ІІ та цисплатину -
пригнічення росту пухлин було в 2,3 та 2,1 рази менше, порівняно з контролем,
а при введенні комплексу ІV - в 1,6 рази менше; зменшенням об’єму
метастатичного ураження: за дії цисплатину, та комплексів ІІ та ІV – даний
показник порівняно з контролем знижувався в 3; 2,2; та 3,5 рази (p<0.05),
відповідно. Для цисплатину та комплексу IV виявлено зменшення частки
метастазів васкулярної фази >1мм (близько 57% та 50% проти 73% в контролі).
6. Встановлено, що комплекс ІІ спричиняє відновлення активності ЦО та
СДГ в мембранах мітохондрій, виділених з пухлинних клітин після терапії
тварин з LLC in vivo в 1,5 рази порівняно з дією цисплатину та відносно
контролю, зниженням активності ЛДГ та ГГТ в сироватці крові
експериментальних тварин, нормалізацією рівня глюкози до показників
інтактних тварин без пухлин.