Гладун Дмитро Володимирович Фізико-хімічні та каталітичні властивості трипсиноподібного та фібриногенолітичного фермен­тів з Антарктичного морського гребінця Adamussium colbecki

Краткое описание

Гладун Дмитро Володимирович, аспірант кафедри біохімії ННЦ «Інститут біології та медицини» Київсько­го національного університету імені Тараса Шевченка МОН України: «Фізико-хімічні та каталітичні властивості трипсиноподібного та фібриногенолітичного фермен­тів з Антарктичного морського гребінця Adamussium colbecki» (03.00.04 - біохімія). Спецрада Д 26.001.24 у Київському національному університеті імені Тараса Шевченка

Київський національний університет імені Тараса Шевченка
Міністерство освіти і науки України
Київський національний університет імені Тараса Шевченка
Міністерство освіти і науки України
Кваліфікаційна наукова
праця на правах рукопису

ГЛАДУН ДМИТРО ВОЛОДИМИРОВИЧ
УДК 595.3.574
ДИСЕРТАЦІЯ
ФІЗИКО-ХІМІЧНІ ТА КАТАЛІТИЧНІ ВЛАСТИВОСТІ
ТРИПСИНОПОДІБНОГО ТА ФІБРИНОГЕНОЛІТИЧНОГО ФЕРМЕНТІВ З
АНТАРКТИЧНОГО МОРСЬКОГО ГРЕБІНЦЯ ADAMUSSIUM COLBECKI
03.00.04 – біохімія
Подається на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук
Дисертація містить результати власних досліджень. Використання ідей,
результатів і текстів інших авторів мають посилання на відповідне джерело
__________ Гладун Д.В.
Науковий керівник Савчук Олексій Миколайович доктор біологічних наук,
старший науковий співробітник.
Київ – 2017

ЗМІСТ
ПЕРЕЛІК УМОВНИХ СКОРОЧЕНЬ.................................................................. 14
РОЗДІЛ 1. ТРИПСИНИ БЕЗХРЕБЕТНИХ ТВАРИН........................................ 21
РОЗДІЛ 2. ФІБРИНОГЕНОЛІТИЧНІ ФЕРМЕНТИ .......................................... 28
РОЗДІЛ 3. СТРУКТУРНО-ФУНКЦІОНАЛЬНІ ОСОБЛИВОСТІ ФЕРМЕНТІВ
З ПСИХРОФІЛЬНИХ ОРГАНІЗМІВ.................................................................. 33
РОЗДІЛ 4. МАТЕРIАЛИ І МЕТОДИ .................................................................. 43
4.1. Реактиви та обладнання.............................................................................. 43
4.2. Одержання загального екстракту тканин ................................................. 44
4.3. Електрофоретичні методи.......................................................................... 45
4.3.1. Приготування проб для електрофорезу .................................................... 45
4.3.2. Одновимірний диск-електрофорез у поліакриламідному гелі за
присутності додецилсульфату натрію................................................................. 46
12
4.3.3. Ензим-електрофорез (зимографія) у поліакриламідому гелі за
присутності додецилсульфату натрію................................................................. 47
4.3.4. Двовимірний електрофорез білків............................................................. 47
4.4. Хроматографічні методи ............................................................................ 48
4.4.1. Синтез афінного сорбенту......................................................................... 48
4.4.2. Хроматографія, що поділяє за розмірами................................................. 49
4.4.3. Афінна хроматографія ................................................................................ 49
4.5. Одержання фібриногену............................................................................. 50
4.6. Визначення фібриногенолітичної та фібринолітичної активності ........ 50
4.7. Оцінка здатності фібриногену до полімеризації ..................................... 51
4.8. Хронометричні тести.................................................................................. 52
4.8.1. Визначення тромбінового часу зсідання плазми ..................................... 52
4.8.2. Визначення протромбінового часу зсідання плазми............................... 52
4.8.3. Визначення активованого часткового тромбопластинового часу
зсідання плазми ..................................................................................................... 52
4.9. Одержання сироватки крові....................................................................... 53
4.10. Одержання плазми, збагаченої тромбоцитами ...................................... 53
4.11. Дослідження процесу агрегації тромбоцитів......................................... 53
4.12. Визначення загальної протеолітичної активності ................................. 54
4.13. Визначення трипсиноподібної активності ............................................. 55
4.14. Визначення активності щодо синтетичних хромогенних субстратів.. 55
4.15. Визначення дії інгібіторів та іонів двовалентних металів.................... 56
4.16. Визначення рН та температурного оптимуму ....................................... 57
4.17. Визначення кінетичних параметрів реакції гідролізу хромогенних
субстратів............................................................................................................ 57
4.18. Визначення концентрації білка ............................................................... 58
4.19. Статистична обробка отриманих результатів ........................................ 58
РОЗДІЛ 5. ХАРАКТЕРИСТИКА ЗАГАЛЬНОГО ЕКСТРАКТУ ТКАНИН
ГІДРОБІОНТУ АНТАРКТИЧНОГО РЕГІОНУ A. COLBECKI........................ 59
РОЗДІЛ 6. ОДЕРЖАННЯ ТА ХАРАКТЕРИСТИКА
ТРИПСИНОПОДІБНОГО ФЕРМЕНТУ З ГДРОБІОНТУ АНТАРКТИЧНОГО
РЕГІОНУ A.COLBECKI........................................................................................ 82
13
6.1. Одержання трипсиноподібного ферменту ............................................... 83
6.2. Характеристика трипсиноподібного ферменту ...................................... 91
РОЗДІЛ 7. ОДЕРЖАННЯ ТА ХАРАКТЕРИСТИКА
ФІБРИНОГЕНОЛІТИЧНОГО ФЕРМЕНТУ З ГДРОБІОНТУ
АНТАРКТИЧНОГО РЕГІОНУ A. COLBECKI................................................. 110
7.1. Одержання фібриногенолітичного ферменту ........................................ 110
ЗАКЛЮЧЕННЯ................................................................................................... 150
ВИСНОВКИ......................................................................................................... 159
СПИСОК ВИКОРИСТАНОЇ ЛІТЕРАТУРИ.................................................... 161
14
ПЕРЕЛІК УМОВНИХ СКОРОЧЕНЬ
АЧТЧ – активований частковий тромбопластиновий час
ДСН – додецилсульфат натрію
ПААГ – поліакриламідний гель
ПЧ – протромбіновий час
TAME –N-α-p-tosyl-L-Arg-methylester
ТПФ – трипсиноподібний фермент
ТХО – трихлороцтова кислота
ТЧ – тромбіновий час
EDTA – етилендіамінтетраоцтова кислота
PMSF – фенілметилсульфонілфлуорид
SBTI – соєвий інгібітор трипсину
BAрNA – N-α-бензоїл-DL-аргінін-р-нітроанілід
S2366 – pyroGlu-Pro-Arg-pNA
S2238 – H-D-Phe-Pip-Arg-pNA
S2222 – Bz-Ile-Glu(γ-OR)-Gly-Arg-pNA
S2251 – H-D-Val-Leu-Lys-pNA
15
Актуальність теми. Вивчення будови та з’ясування теоретичних основ
взаємозв’язку між структурою і механізмом дії ферментів, а також розробка
рекомендацій щодо їх практичного застосування безумовно належать до
пріоритетних напрямків сучасних наукових досліджень, зокрема, у галузі
біохімії та біотехнології. Незважаючи на інтенсивні дослідження, ця
проблема не втрачає своєї актуальності, оскільки розвиток сучасних
технологій у поєднанні із застосуванням наукових підходів і методів,
дозволяє не лише визначити тонкі механізми дії біокаталізаторів та
знаходити шляхи регулювання процесів in vitro, та in vivo, а й значно
спростити багатостадійну процедуру одержання ферментних препаратів. На
сьогодні гідролітичні ферменти широко застосовуються у різних галузях
промисловості, сільському господарстві, медицині, фармакології [1, 2]. Окрім
значного практичного потенціалу ферменти є важливим інструментом для
проведення фундаментальних досліджень в галузі вивчення структурних та
функціональних особливостей білків [3]. Детальне дослідження будови та
властивостей ферментів із організмів різних таксономічних рангів має
першочергове значення для кращого розуміння механізмів таких складних
біологічних явищ як диференціювання та морфогенез, поділ та
трансформація, адаптаційні перебудови обміну речовин, є важливим для
розшифрування молекулярних основ еволюції. Тому пошук нових
економічно обгрунтованих джерел сировини та розробка нових підходів
щодо швидкого скринінгу, одержання та очистки цільових молекул набуває
особливого значення як для академічної науки в цілому, так і для практичної
біотехнології та фармакології. В цьому контексті увагу привертає Світовий
океан, біологічне розмаїття якого складає фактично необмежений ресурс в
галузі одержання різноманітних за будовою та спектром біологічних
активностей речовин [4, 5]. Перспективність використання морських
гідробіонтів, як джерела для одержання гідролітичних ферментів, зумовлена
не лише їх значною сировинною базою, а й присутністю ферментів, які за
16
своїми структурно-функціональними характеристиками можуть відрізнятися
від ферментів з наземних організмів. Так, зокрема, ферменти, одержані з
організмів, адаптованих до низьких температур навколишнього середовища,
характеризуються вищою каталітичною ефективністю при температурах
близьких до нуля, широкою субстратною специфічністю та нижчою
термостабільністю у порівнянні з аналогічними мезофільними ферментами з
[6, 7]. Гідробіонт Adamussium colbecki, як один з видів, що населяють
антарктичний регіон та пристосовані до існування за понижених температур,
може бути потенційно перспективним об’єктом для одержання ферментів з
нетиповими характеристиками та дослідження їх властивостей.
Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами.
Дисертаційну роботу виконано на кафедрі біохімії ННЦ «Інститут біології та
медицини» Київського національного університету імені Тараса Шевченка у
рамках науково-дослідних тем: «Механізми реалізації адаптаційно
компенсаторних реакцій організму за умови розвитку різних патологій»
(№ д/р 0111U004648, 2011–2015 рр.) та «Механізми регуляції метаболічних
процесів в організмі за умов розвитку патологічних станів»
(№ д/р 0116U002527, 2016–2018 рр.).
Мета і задачі дослідження. Метою роботи було одержати
трипсиноподібний та фібриногенолітичний ферменти з Антарктичного
морського гребінця Adamussium colbecki та вивчити їх основні фізико-хімічні
і каталітичні властивості.
Для досягнення мети було поставлено наступні задачі:
1. Проаналізувати якісний білково-пептидний склад та спектр ферментів з
різною будовою активного центру у загальному екстракті тканин гідробіонту
A. colbecki.
2. Одержати трипсиноподібний і фібриногенолітичний ферменти, визначити
їх молекулярні маси, субстратну специфічність щодо певних синтетичних і
17
білкових субстратів та дослідити основні кінетичні параметри реакції
гідролізу хромогенних субстратів.
3. Визначити температурний та рН оптимум для трипсиноподібного і
фібриногенолітичного ферментів і вивчити вплив інгібіторів протеїназ та
іонів двохвалентних металів на активність даних ферментів.
4. Дослідити вплив фібриногенолітичного ферменту на окремі параметри
системи гемостазу.
Об’єкт дослідження:трипсиноподібний та фібриногенолітичний
ферменти з гідробіонту A.colbecki.
Предмет дослідження: біохімічні, фізико-хімічні, каталітичні
властивості ферментів
Методи дослідження: хроматографічні (одержання та очищення
трипсиноподібного та фібриногенолітичного ферментів),
електрофоретичні (аналіз якісного білково-пептидного складу тканин,
оцінка гомогенності одержаних ферментів, ідентифікація активних
ферментів, визначення ізоелектричних точок), спектрофотометричні
(визначення активності ферментів), агрегометричні (дослідження процесу
агрегації тромбоцитів), коагулометричні (проведення хронометричних
тестів) та методи математичної статистики.
Наукова новизна одержаних результатів. Вперше одержано
трипсиноподібний і фібриногенолітичний ферменти з гідробіонту
антарктичного регіону A. colbecki та охарактеризовано їх основні фізикохімічні властивості, зокрема, визначено молекулярну масу, температурний та
рН оптимум, досліджено вплив іонів двовалентних металів та інгібіторів
протеаз на активність одержаних ферментів. Виявлено вищу активність обох
досліджуваних ферментів при використанні синтетичних субстратів, що
містять у Р1-положенні залишок аргініну, у порівнянні з субстратом, що має у
даному положені залишок лізину. Вперше визначено кінетичні параметри
(КM, kcat, kcat/КM) реакції гідролізу трипсиноподібним і фібриногенолітичним
18
ферментами синтетичних субстратів та досліджено залежність значень
кінетичних констант гідролізу трипсиноподібним ферментом синтетичного
субстрату від температури. Результати роботи доповнюють існуючі на
сьогодні уявлення щодо фізико-хімічних та каталітичних властивостей
ферментів з організмів, пристосованих до низьких температур середовища
існування, та вносять певний вклад у розуміння ролі протеолітичних
ферментів у механізмах біохімічної адаптації організму. Одержані у
дисертації дані є певним доробком у галузі еволюційної біохімії, оскільки
сприяють кращому розумінню молекулярних основ еволюції ферментів.
Визначено специфічність фібриногенолітичного ферменту щодо ланцюгів
фібриногену та встановлено його належність до металопротеїназ. Виявлено
порушення здатності фібриногену до полімеризації та утворення
фібринового згустку, а також пригнічення процесу АДФ-залежної агрегації
тромбоцитів за дії фібриногенолітичного ферменту.
Практичне значення одержаних результатів. Оптимізовано методику
одержання та очищення трипсиноподібного і фібриногенолітичного
ферментів з гідробіонту антарктичного регіону, яка в подальшому може бути
використана як основа для розробки технологій одержання протеолітичних
ферментів аналогічного спектру дії з тканин морських гідробіонтів.
Одержаний фібриногенолітичний фермент з огляду на його вплив на процеси
полімеризації фібриногену, здатність гідролізувати фібриновий згусток та
пригнічувати процес АДФ-індукованої агрегації тромбоцитів, може бути
потенційно перспективним для розробки терапевтичних засобів,
спрямованих на зниження гемостатичного потенціалу крові. Окрім того,
даний фібриногенолітичний фермент може бути використаний як додатковий
інструмент для більш детального вивчення закономірностей процесу
полімеризації фібриногену та дослідження структурних взаємодій з іншими
білками. Отримані у дисертаційній роботі дані впроваджено у навчальний
19
процес курсів лекцій «Біохімічні основи гемостазу та діагностика», «Методи
практичної біохімії».
Особистий внесок здобувача. Дисертантом особисто проаналізовано
наукову літературу за темою дослідження, інтерпретовано отримані
експериментальні результати, здійснено їх статистичну обробку, оформлено
рисунки та таблиці. Експериментальна частина дисертаційної роботи була
виконана здобувачем особисто або за його безпосередньої участі.
Планування експерименту та розробка методичних підходів, формування ідеї
роботи, узагальнення результатів досліджень та редагування дисертаційної
роботи здійснено спільно з науковим керівником.
Автор висловлює глибоку вдячність к.б.н. Ракши Н.Г. за допомогу в
плануванні та проведенні досліджень, співучасть якої у виконанні роботи
представлена в спільних публікаціях.
Апробація результатів дисертації. Результати дисертації доповідались
на вітчизняних та міжнародних конференціях, зокрема, IX Всеукраїнській
науково-практичній конференції «Біотехнологія ХХ століття» (Київ 2015), VI
Міжнародній конференції «Антарктичні дослідження: нові горизонти та
пріоритети» (Київ 2015), X Міжнародній конференції «Біологія: від молекули
до біосфери» (Харків 2015), VIIІ Міжнародній конференції присвяченій 25-
річчю приєднання України до Договору про Антарктику (Київ 2017).
Публікації. За темою дисертації опубліковано 20 наукових праць, в тому
числі 8 статей у фахових виданнях, рекомендованих ДАК України, 4 статті в
іноземних виданнях, 8 публікацій у матеріалах з’їздів та конференцій.
Структура та обсяг дисертації. Дисертація викладена українською
мовою на 196 сторінках друкованого тексту і складається із вступу, огляду
літератури, матеріалів і методів дослідження, результатів роботи та їх
обговорення, висновку та списку використаних літературних джерел, що
20
містить 292 найменування. Робота ілюстрована 12 таблицями та 34
рисунками.

Список литературы

ЗАКЛЮЧЕННЯ
Ферменти з організмів, адаптованих до низьких температур, через певні
структурно-функціональні особливості привертають значну увагу науковців
як потенційно перспективні не лише з практичної точки зору, а і як цінні
інструменти для проведення фундаментальних досліджень. Організми, здатні
виживати та успішно розвиватися за понижених температур навколишнього
середовища, називаються психрофільними. Істинними психрофілами є ті, для
яких оптимальною для функціонування є температура нижче 15°С.
Незважаючи на широке розповсюдження та різноманіття, будова та
властивості ферментів з психрофілів залишаються недостатньо вивченими,
що обумовлює актуальність проведення комплексних досліджень в даному
напрямку. Адаптація до низьких температур середовища забезпечується
низкою генетично детермінованих механізмів, що реалізуються на різних
рівнях організації. Так, на рівні цілого організму формуються спеціальні
поведінкові реакції (міграції), метаболічні пристосування (оціпеніння,
сплячка). На молекулярному рівні адаптація включає синтез антифризних
білків; певними особливостями характеризується енергетична система,
механізми синтезу та деструкції білків, система транспорту. Особливе місце
відводиться адаптації на молекулярному рівні - так званому феномену
температурної компенсації ферментних систем психрофілів. В першу чергу
на флуктуації параметрів зовнішнього середовища реагують ферменти, що
дозволяє проявляти ферментативну активність та підтримувати належну
швидкість обмінних процесів, незважаючи на сповільнення метаболічних
реакцій за низьких температур. Ферменти з психрофільних організмів здатні
компенсувати зниження швидкості реакцій за рахунок підвищення
каталітичної ефективності. Порівняння кінетичних параметрів гідролізу
субстратів гомологічними ферментами з психрофільних, мезофільних і
термофільних об’єктів виявили, що їх питомі активності за умов
151
температурного оптимуму, як правило, є подібними. Тобто, ефективність
ферментів з психрофільних організмів є досить високою. На сьогодні точні
молекулярні механізми даного явища залишаються остаточно не
з’ясованими, але вважається, що висока каталітична ефективність ферментів
з психрофілів пов’язана, насамперед, з більшою лабільністю ділянок
молекули ферменту, що безпосередньо залучені до каталізу.
Вивчення структурно-функціональних особливостей ферментів,
адаптованих до функціонування за низьких температур, становить значний
інтерес не лише для фундаментальної науки, а є досить привабливим з
позицій їх потенційного практичного застосування. На сучасному етапі
економічного розвитку сфера використання ферментів надзвичайно широка і
включає різні галузі промисловості, сільське господарство, біотехнологічне
виробництво. Важливою областю застосування препаратів на основі
ферментів є медицина, де їх призначають як основний засіб, а також як
допоміжний компонент під час терапії гастро-ентерологічних захворювань,
гнойно-некротичних процесів, використовують у стоматології,
офтальмології, отоларингології, гінекології.
Окрім значного практичного потенціалу, ферменти, адаптовані до
функціонування за низьких температур, є важливими об’єктами для
проведення фундаментальних досліджень, пов’язаних з вивченням
структурних основ високої каталітичної ефективності даних ферментів.
Дослідження у даному напрямку дозволять доповнити існуючі на сьогодні
уявлення щодо адаптаційних стратегій, зокрема, молекулярних механізмів
холодової адаптації. Вивчення особливостей ферментів з психрофілів має
суттєве значення для білкової інженерії, оскільки чітке розуміння механізмів
взаємозв’язку між структурою та функцією дозволить створювати молекули з
заданими характеристиками. Окрім того, порівняльний аналіз
амінокислотного складу, структури та кінетичних параметрів ферментів з
152
організмів різних таксономічних рангів сприятиме розширенню уявлень про
еволюцію ферментів.
До ферментів, що виявлені у більшості організмів, незалежно від їх
таксономічного положення, належать трипсини. Незважаючи на те, що
будова, властивості та залучення даних ферментів у реалізацію базових
фізіологічних функцій та розвиток патологічних процесів є добре
дослідженими, робіт, присвячених вивченню властивостей трипсинів з
психрофільних безхребетних в сучасній літературі не так багато.
A. colbecki як гідробіонт Антарктичного регіону, де середня температури
води складає 0°С, може розглядатися як потенційно перспективний об’єкт
для одержання та вивчення властивостей ферментів з нетиповими
властивостями.
Висновок щодо доцільності використання гідробіонту A. colbecki, як
джерела для одержання ферментів, було зроблено на основі результатів
аналізу якісного білково-пептидного складу тканин даного гідробіонту та з
огляду на присутність протеолітичних ферментів з різною будовою
активного центру. Так, відповідно до результатів проведених
електрофоретичних досліджень, загальний екстракт тканин гідробіонту
містив широкий спектр білків з молекулярними масами у діапазоні від 10 до
150 кДа; при цьому домінуюча частина білків була представлена аніонними
ізоформами, ізоелектричні точки яких знаходилися у межах двох інтервалів
рН – 3,5–4,0 та 5,5–5,9. Застосування методу ензим-електрофорезу показало
присутність активних протеаз, що виявляли активність щодо желатину,
фібриногену та колагену. Проведений аналіз, з використанням інгібіторів
протеаз, виявив, що близько 53% від загальної протеолітичної активності
обумовлено сериновими протеазами, серед яких до 95% активності
опосередковується трипсиноподібною активністю. Близько 20%
ферментативної активності належить металозалежним протеазам, а решта
153
27% активності може бути пов’язана із присутністю цистеїнових та
аспартильних протеаз.
В результаті фракціонування загального екстракту тканин гідробіонту
на окремі фракції методом хроматографії, що поділяє за розмірами, на
колонці з носієм Superdex 75 PG було одержано 5 фракцій, що містили білки
з молекулярними масами від 30 і до 75 кДа та вище: 1 фракція містила білки з
масою вище 75 кДа, 2 фракція – 75-65 кДа, 3 фракція – 65-45 кДа, 4 фракція –
45-40 кДа, 5 фракція – 40-30 кДа. Оскільки, відповідно до результатів
інгібіторного аналізу, протеази у екстракті тканини гідробіонту представлені
переважно сериновими, зокрема, трипсиноподібними та металозалежними
ферментами, кожна фракція була протестована на наявність
трипсиноподібної та колагенолітичної активності. Також було визначено
казеїнолітичну активність, яка дозволяє зробити висновок про загальну
протеолітичну активність. Даний тип активності було виявлено у всіх
досліджуваних фракціях, що вказує на наявність у екстракті тканини A.
colbecki активних форм як високо-, так і низькомолекулярних протеолітичних
ферментів та слугує непрямим підтвердженням певного протеолітичного
потенціалу досліджуваного гідробіонту. Застосування специфічного для
трипсинів субстрату BAрNA виявило присутність ферментів, здатних
гідролізувати даний субстрат, у фракціях, що містять білки з молекулярними
масами від 30 до 65 кДа, найвищу активність було зареєстровано у фракції,
білки якої мають молекулярну масу 30-40 кДа. Такі результати в цілому
узгоджуються з даними літератури щодо молекулярної маси трипсинів та
трипсиноподібних ферментів. Присутність колагенолітичної активності лише
у фракції білків з молекулярними масами близькол 30 кДа опосередковано
може вказувати на належність даних ферментів до серинових
колагенолітичних ферментів, адже відомо, що у тканинах нижчих
гідробіонтів поряд з високомолекулярними (40-150 кДа) металозалежними
154
колагеназами є низькомолекулярні (нижче 30 кДа) колагенолітичні ферменти
активний центр яких містить залишок Ser.
Узагальнюючи результати даного етапу роботи, можемо зробити
висновок, що основна частина протеолітичної активності у тканинах
досліджуваного гідробіонту обумовлена сериновими протеазами, зокрема
тими, що мають трипсиноподібну активність.
Тому, з огляду на одержані нами результати, наступний етап роботи
передбачав одержати та охарактеризувати трипсиноподібний фермент. Варто
зазначити, що певні структурні відмінності білків з психрофільних організмів
обумовлюють необхідність розробки нових чи оптимізації існуючих методів
їх виділення, очистки та стабілізації, оскільки загальноприйняті методичні
підходи у більшості випадків виявляються малоефективними. Це відноситься
як до методів роботи з тканинними екстрактами, так і з чистими ферментами
чи іншими фракціями біологічно активних речовин. Нами було розроблено
ефективну схему очистки ферменту, яка поєднувала два хроматографічні
підходи (афінну хроматографію та хроматографію, що поділяє за розмірами)
та дозволила одержати гомогенний фермент з виходом 50,3% та ступенем
очистки 7,5. Належність одержаного ферменту до трипсинів була
підтверджена результатами інгібіторного аналізу, відповідно до яких,
інкубація з інгібітором серинових протеаз PMSF та специфічним інгібітором
трипсинів SBTI обумовлювала пригнічення активності ферменту, в той час
як за використання інгібітору металозалежних ферментів EDTA, інгібуючого
впливу виявлено не було. Додатковим підтвердженням трипсинової природи
одержаного ферменту може слугувати прояв ферментативної активності
щодо класичного субстрату для дослідження властивостей трипсинів N-αbenzoyl-DL-Arg-pNA та відсутність ферментативної активності у випадку
використання субстрату для хімотрипсину Ac-Phe-pNA.
В цілому за своїми основними фізико-хімічними характеристиками
трипсиноподібний фермент, одержаний з А. colbecki, виявився подібним до
155
більшості трипсинів ссавців та безхребетних. Так, фермент виявляв більш
виражену активність при використанні ефірного субстрату N-α-p-tosyl-L-Argmethylester у порівнянні з амідним субстратом N-α-benzoyl-DL-Arg-pNA.
Швидкість гідролізу р-нітроанілідних субстратів, що містили у Р1-положенні
залишок Arg була суттєво вищою у порівнянні з субстратом, що містив у
даному положенні залишок Lys; ефективність гідролізу залежала від
довжини пептидного ланцюга субстрату і зростала з його подовженням.
Оптимуму рН, подібно до інших трипсинів, знаходився в області лужних
значень рН і складав 9,0. Однією з основних відмінностей
трипсиноподібного ферменту, одержаного з гідробіонту А. colbecki, від
«класичних» трипсинів є значення температурного оптимуму, яке було
встановлено при температурі 24°С. Даний показник виявився значно нижчим
за оптимальні температури, характерні для трипсинів мезофільних
організмів, але знаходився в інтервалі температурного оптимуму,
характерного для трипсиноподібних ферментів, одержаних з організмів,
адаптованих до низьких температур середовища. Порівняння кінетичних
параметрів реакції гідролізу субстрату pyroGlu-Pro-Arg-pNA за температури,
оптимальної для прояву ферментативної активності (24°С) та температури
8
°С, яка є середньою температурою середовища існування істинних
психрофітів, виявило суттєве зниження значень КМ з 0,68±0,07 мМ при 240С
до 0,39±0,09 мМ при 8°С. При цьому каталітична константа kcat також
знижувалась. Незважаючи на зниження обох кінетичних констант,
каталітична ефективність гідролізу субстрату kcat/KМ залишалась незмінною
при обох температурах і складала 15,32±0,2 мМ-1
∙с-1 при 24°С та 16,33±0,3
мМ-1
∙с-1
при 8
°С. На основі одержаних нами результатів можемо припустити,
що один з механізмів адаптації трипсиноподібного ферменту до
функціонування при низьких температурах середовища пов’язаний з
підвищенням спорідненості субстрату до ферменту. Слід відмітити, що для
більшості досліджених на сьогодні ферментів з психрофільних організмів,
156
підвищення каталітичної ефективності відбувається за рахунок підвищення
ефективності зв’язування субстрату з ферментом. Виявлена нами стратегія
адаптації за рахунок зниження значень KМ характерна для деяких видів риб –
G. morhua, P. magellanica, S. gairdneri, що живуть за низьких температур
середовища.
Оскільки однією із виражених активностей, визначених на етапі оцінки
протеолітичного потенціалу гідробіонту, була фібриногенолітична
активність, наступний блок досліджень включав одержання та
характеристику фібриногенолітичного ферменту. Додатковим
обгрунтуваннням вибору саме фібриногенолітичного ферменту, як об’єкту
для дослідження, стала існуюча на сьогодні нагальна потреба у ефективних
та безпечних засобах, здатних швидко знижувати вміст фібриногену у
кровотоці, адже відомо, що серцево-судинні захворювання, патогенез яких
ускладнений тромботичними порушеннями, є однією з ключових причин
летальних випадків та інвалідизації серед працездатного населення.
Варто зазначити, що використання для одержання фібриногенолітичного
ферменту ліофілізату фракції, що не зв’язалася з SBTI-сефарозою 4В на етапі
одержання з трипсиноподібного ферменту, дозволило відразу відділити
ферменти, що володіють трипсиноподібною активністю. В результаті
поєднання декількох хроматографічних стадій, зокрема, афінної
хроматографії на колонці з Blue-сефарозою 6 FF та хроматографії, що
поділяє за розмірами, на колонці HiLoad 16/60 Superdex 200 PG, було
одержано електрофоретично гомогенний фермент з молекулярною масою
близько 40 кДа. Виражена специфічність даного ферменту щодо Аα-ланцюгів
фібриногену та значне пригнічення його активності при додаванні EDTA, а
також відсутність інгібуючого впливу за інкубації з PMSF дозволило
віднести одержаний нами фермент до металопротеаз. Фібриногенолітичний
фермент належить до лужних протеаз – його рН оптимум знаходиться при рН
10,0. Активність ферменту значно пригнічувалась за інкубації з іонами Zn2+
157
та Сu2+ та незначно зростала при додаванні іонів Mg2+. Пригнічення
активності ферменту при додаванні цистеїну дозволяє зробити висновок про
важливість вільних SH-груп для прояву каталітичної активності. Одержаний
нами фібриногенолітичний фермент обумовлював порушення здатності
молекул фібриногену до полімеризації та утворення фібринового згустку, що
було підтверджено результатами трьох базових хронометричних тестів
оцінки стану плазменного гемостазу та безпосереднім зниженням
концентрації фібриногену, здатного до полімеризації, після інкубації з
досліджуваним фібриногенолітичним ферментом. Окрім здатності
розщеплювати фібриноген, фермент володів певною фібринолітичною
активністю; при цьому специфічність щодо ланцюгів фібрину було подібна
до такої, стосовно ланцюгів фібриногену – першим гідролізу зазнавав саме
Аα-ланцюг. Ще одним наслідком розщеплення фібриногену за дії
фібриногенолітичного ферменту може бути виявлене нами пригічення
процесу АДФ-залежної агрегації тромбоцитів, оскільки відомим є факт, що
необхідною умовою агрегації є присутність фібриногену – важливого
кофактору даного процесу. Відповідно до результатів субстратного аналізу,
фібриногенолітичний фермент виявляв значно вищу активність щодо
субстратів, що містять у Р1-положенні залишок Arg, у порівнянні з тими, що
містять у даному положенні залишок Lys. Враховуючи належність
одержаного нами ферменту до металопротеаз, виявлена специфічність щодо
р-нітроанілідних субстратів є не зовсім типовою та опосередковано може
свідчити про широку субстратну специфічність досліджуваного ферменту.
Незважаючи на таку відносно широку субстратну специфічність та той факт,
що більшість металопротеаз здатні ефективно розщеплювати не лише ряд
білків системи гемостазу, а й білки мембран ендотеліальних клітин та
базальних мембран, обумовлюючи розвиток кровотеч, одержаний нами
фібриногенолітичний фермент не виявляв активності стосовно колагену –
важливого компоненту базальних мембран та позаклітинного матриксу, що
158
може слугувати непрямим підтвердженням відсутності у даного ферменту
вираженої геморагічної активності.
Узагальнюючи, нами було одержано в гомогенному вигляді
трипсиноподібний (23 кДа) та фібриногенолітичний (40 кДа) ферменти,
пригнічення активності яких за дії, відповідно, PMSF і EDTA дозволяє
віднести досліджувані ферменти до серинових протеаз та металопротеаз. Такі
результати в цілому узгоджуються з даними щодо представництва ферментів
з різною будовою активного центру у загальному екстракті тканини
гідробіонту A. colbecki, згідно з якими основна частина ферментів даного
організму представлена сериновими протеазами, зокрема,
трипсиноподібними, а також металозалежними ферментами. Проведені
дослідження свідчать про перспективність використання гідробіонту
A. colbecki як потенційного джерела зазначених ферментів та обгрунтовують
доцільність проведення подальших досліджень, спрямованих на більш
детальне вивчення будови та фізіологічних ефектів даних ферментів з
перспективою створення на їх основі препаратів для лікування патологічних
проявів, асоційованих з надмірними тромбоутворенням чи активізацією
гнійно-некротичних процесів