Мезенхимальные стволовые клетки в лечении идиопатического легочного фиброза Сотникова Анна Геннадьевна

Краткое описание

Сотникова Анна Геннадьевна. Мезенхимальные стволовые клетки в лечении идиопатического легочного фиброза: диссертация ... кандидата Медицинских наук: 14.01.25 / Сотникова Анна Геннадьевна;[Место защиты: ФГБУ «Научно-исследовательский институт пульмонологии Федерального медико-биологического агентства»], 2019
ОГЛАВЛЕНИЕ ДИССЕРТАЦИИкандидат наук Сотникова Анна Геннадьевна
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Эпидемиология, факторы риска и патогенез идиопатического легочного фиброза
1.2. Диагностика и лечение идиопатического легочного фиброза
1.3. Виды стволовых клеток и механизмы их действия
1.4. Стволовые клетки в легких
1.5. Эффекты клеточной терапии в экспериментальных моделях легочного фиброза
1.6. Клинические исследования эффектов клеточной терапии при ИЛФ
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Экспериментальное исследование
2.1.1. Оценка выживаемости мезенхимальных стволовых клеток при разных методах небулизации
2.1.2. Клеточный препарат для экспериментального этапа
2.1.3. Экспериментальная модель
2.1.4. Морфологическое и иммуногистохимическое исследование ткани легких экспериментальных животных
2.1.5. Конфокальная лазерная эндомикроскопия
2.2. Пилотное клиническое исследование
2.2.1. Характеристика пациентов
2.2.2. Критерии включения/исключения
2.2.3. План исследования
2.2.4. Оценка безопасности и эффективности
2.2.5. Клеточный препарат для клинического исследования
2.2.6. Методы диагностики
2.2.7. Статистическая обработка результатов
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
3.1. Экспериментальное исследование
3.1.1. Выживаемость мезенхимальных стволовых клеток при распылении в разных типах небулайзеров
3.1.2. Эффекты МСК при ингаляционной и внутривенной доставке в легкие
3.2. Пилотное клиническое исследование безопасности и эффективности аллогенных МСК костного мозга у пациентов с идиопатическим легочным фиброзом с быстрым снижением функции легких
3.2.1. Оценка безопасности высокой кумулятивной дозы аллогенных мезенхимальных стволовых клеток костного мозга
3.2.2. Оценка эффективности высокой кумулятивной дозы аллогенных МСК
у пациентов с идиопатическим легочным фиброзом
ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ

Список литературы

Эпидемиология, факторы риска и патогенез идиопатического легочного фиброза
Идиопатический легочный фиброз (ИЛФ) специфическая форма хронической фиброзирующей интерстициальной пневмонии неизвестной этиологии, имеющая прогрессирующее течение, которая встречается преимущественно в пожилом возрасте, ограничена легкими и ассоциирована с гистопатологическим и/или КТВР паттерном обычной интерстициальной пневмонии [1]. ИЛФ наиболее распространенная форма среди идиопатических интерстициальных пневмоний (ИИП), составляющая от 50 до 60% случаев в данной группе заболеваний [14]. Например, в США распространенность ИЛФ колеблется от 14 до 42,7 на 100 000 населения с постоянным ростом заболеваемости за последние 20 лет [15]. Если экстраполировать результаты этих эпидемиологических исследований на российскую популяцию, можно сделать вывод, что в России не меньше 30 тысяч больных ИЛФ, однако в силу низкого уровня диагностики, недостаточных знаний и настороженности среди врачей в отношении данного заболевания, диагноз ставится намного реже. Так, на начало 2019 г. в национальном регистре ИЛФ было зарегистрировано чуть более 1000 пациентов, причем не более 1/3 из них имели подтвержденный диагноз [16]. Поскольку ИЛФ чаще всего возникает у лиц старше 50 лет и учитывая старение населения за счет роста продолжительности жизни, большинство экспертов в области интерстициальных болезней легких считает, что распространенность ИЛФ будет расти и в будущем [17].
Так, в британской популяции ежегодный прирост заболеваемости ИЛФ составляет около 5%. В целом, в Евросоюзе ежегодно диагноз ИЛФ ставится примерно 40 тысячам новым пациентам [2]. Среди хронических интерстициальных заболеваний легких ИЛФ имеет самые высокие темпы прогрессирования, и худшие показатели смертности, сопоставимые с наиболее агрессивными формами рака, с медианой выживаемости в 3-4 года с момента постановки диагноза [18].
Факторы риска. Несмотря на то, что этиология ИЛФ не установлена, факторы риска (ФР) развития заболевания изучены достаточно хорошо.
Курение один из главных ФР ИЛФ. Около 70% заболевших ИЛФ, ранее курили или продолжали курить к моменту постановки диагноза. Чаще всего болезнь развивается у больных со стажем курения более 20 пачка/лет [19]. Существует дозо-зависимый эффект курения в отношении риска ИЛФ. Каждый пачка-год увеличивает вероятность заболевания на 3% у продолжавших курить и на 2% у бросивших курить [20]. Вероятно, именно с распространенностью курения в мужской популяции связана большая заболеваемость ИЛФ среди мужчин.
Механизмы, определяющие влияние табакокурения на развитие ИЛФ окончательно не установлены. Предполагается, что имеет значение прямое токсическое влияние компонентов табачного дыма на эпителий, свободнорадикальные процессы индуцированные вдыханием табачного дыма, активация нейтрофилов с увеличением протеазной активности, подобные тем, которые происходят при ХОБЛ. Оксидативный стресс является индуктором экспрессии гена MUC5B, который, как уже упоминалось ранее, ассоциирован с развитием легочного фиброза [21]. В последнее время описаны эпигенетическое влияние курения, а также поллютантов на процессы метилирования ДНК, которые наблюдаются также при раке легкого. Гиперметилирование участка ДНК Thy-1 приводит к уменьшению синтеза соответствующего гликопротеина фибробластами и трансформации фибробластов в миофибробласты [22]. Несмотря на сильную корреляционную связь табакокурения и развития ИЛФ, данное заболевание не относится к группе ИИП, ассоциированных с курением [23].
Поллютанты окружающей среды. Связь между развитием ИЛФ и экспозицией аэрополлютантов, особенно профессионально обусловленная, изучена меньше, чем с другими факторами риска. Ряд исследований выявили, что при хроническом вдыхании металлической, древесной, кремний-содержащей, а также органической пыли, повышается как риск развития локальных фиброзов легких, так и ИЛФ, причем эта вероятность выше у мужчин [24] В исследовании случай-контроль среди 137 больных ИЛФ из шведского регистра, имевших более чем 10 летний анамнез контакта с различными пылевыми факторами был установлен в 68% случаев (также как и анамнез курения). В контрольной группе факт экспозиции поллютантов подтвержден был у 55% опрошенных (курение в анамнезе у 52%) [20]. Нельзя, правда, исключить, что в выборку ИЛФ попали пациенты с хроническим течением экзогенного альвеолита, практически не отличимого на поздних стадиях от ИЛФ.
Имеются данные об особенностях ИЛФ, ассоциированного с пылевыми факторами. В крупном исследовании в корейской популяции, у пациентов ИЛФ, имевших контакт с производственной пылью, наблюдалось более раннее начало заболевания и худший прогноз в сравнении с остальными больными [25] Однако в целом, роль аэрополлютантов в развитии ИЛФ, вероятно, является недооцененной. Тщательный сбор профессионального анамнеза и особенностей воздушной среды пребывания пациента ИЛФ необходим для исключения возможного провоцирующего фактора болезни. Тем не менее, к трактовке контактов с органической пылью, как возможному фактору, индуцирующему ИЛФ, следует подходить очень взвешенно, поскольку хронические формы экзогенного аллергического альвеолита могут быть практически неотличимы по КТВР от ИЛФ, часто имеют паттерн обычной интерстициальной пневмонии не только рентгенологически, но и при гистологическом исследовании.
Пожилой возраст. ИЛФ болезнь пожилых людей (средний возраст пациентов 66 лет) и редко встречается до 50 лет [26]. Крупное эпидемиологическое исследование в США показало, что у лиц старше 65 лет цифры заболеваемости и распространенности ИЛФ составляют соответственно 93,7 и 494,5 на 100 000 населения, что на порядок выше, чем в более младшей возрастной группе (до 65 лет) [27]. Одной из гипотез развития ИЛФ является гипотеза ускоренного старения ткани легких [28]. У пациентов ИЛФ установлен целый ряд механизмов, которые лежат в основе процесса старения. Первый из них нестабильность генома, вследствие накопления повреждений ДНК, которых гораздо больше при ИЛФ, чем у лиц того же возраста, не страдающих данным заболеванием [29].
Эпигенетическое влияние, в частности гиперметилирование ДНК эпителиальных клеток, также ассоциированы с ускоренным старением и неконтролируемым фиброобразованием. Следующий факт, относящийся к ИЛФ, ускорение физиологического старения эпителиальных клеток, которые экспрессируют в повышенном количестве маркеры «старения» -галактозидазу и циклин-зависимый киназный ингибитор [30]. По-видимому, при ИЛФ раннее старение клеток происходит не только в ткани легких. Так, мезенхимальные стволовые клетки костного мозга, выделенные у пациентов с ИЛФ, также имеют признаки глубокого физиологического старения [31].
В рамках нарушения клеточного гомеостаза активно обсуждается митохондриальная дисфункция и деградация клеточных белков вследствие повышения активности протеолитических систем [32]. Наконец, истощение ресурсов резидентных стволовых клеток, являющихся источником регенерации в легких, также отражает процесс ускоренного старения, имеющий место у больных ИЛФ [32].
Гастроэзофагеальный рефлюкс. Значительное число исследований доказало высокую корреляционную связь между ИЛФ и ГЭР. Суточное мониторирование РН пищевода выявило повышение кислотности в 87-94% случаев ИЛФ, что существенно выше, чем в общей популяции, причем в 54-75% случаев ГЭР не имел классических клинических проявлений, таких как изжога и отрыжка [33, 34]. Число эпизодов ГЭР напрямую связано со степенью выраженности фиброза по данным КТВР [35]. Предполагается, что регулярная микроаспирация желудочного сока является фактором, способствующим запуску хронического повреждения эпителия воздухоносных путей при ИЛФ. Однако не исключается и обратное влияние развитие рефлюкса в силу изменения внутригрудного давления из-за уменьшения растяжимости фиброзированных легких. Несомненные факты связи ГЭР и ИЛФ привели к включению антирефлюксных препаратов в эмпирические схемы лечения ИЛФ в 2015 г. консенсусом ATS/ERS/JRS/ALAT, однако с подчеркиванием малой доказательности таких рекомендаций [36]. Действительно, ряд исследований не выявили пользы от назначения антацидных препаратов при ИЛФ. В работе G Raghu было показано, что назначение ингибиторов протонной помпы у 63% пациентов не приводит к нормализации кислотности пищевода [34]. Исследования INPULSIS у ряда пациентов, получающих ингибиторы протонной помпы, выявили ухудшение легочной функции [4]. Одно из исследований, оценивавших влияние ИПП и Н2-гистаминоблокаторов на функцию легких у пациентов, получавших пирфенидон, показало, что их включение в схему лечения не улучшает результаты, но повышает риски респираторных инфекций у пациентов с FVC 70% [37].
Инфекция. Первичное повреждение эпителия, запускающее процесс фиброобразования в ткани легких, по-видимому, может быть вызвано не только курением, поллютантами и ГЭР, но также инфекционным фактором. У больных ИЛФ выявлено более широкое носительство герпесвирусов (особенно вируса Эпштейна-Барр), вируса гепатита С, цитомегаловируса чем в общей популяции [38, 39]. Не исключено, что те же самые вирусы, а также вирус гриппа H1N1 играют роль в индуцировании обострений ИЛФ [40].
Бактериальные инфекции также, по-видимому, вносят определенный вклад в патогенез легочного фиброза. Присутствие ДНК Streptococcus и Staphylococcus выше порогового уровня в жидкости БАЛ ассоциировалось со снижением выживаемости пациентов с ИЛФ [41]. Назначение котримоксазола в дозе 960 мг 2 раза в сутки в течение 12 месяцев у пациентов ИЛФ хотя и улучшило функциональные параметры, привело к достоверному снижению летальности в группе антибактериальной терапии [42].
В целом эксперты сходятся во мнении, что роль острой инфекции и изменений микробиома НДП в развитии ИЛФ является недостаточно изученной, тем не менее, вряд ли разработка данного направления принесет существенные плоды с точки зрения получения принципиально новых подходов в лечении пациентов с ИЛФ [43].
Клинические исследования эффектов клеточной терапии при ИЛФ
Первым оригинальным исследованием по клеточной терапии фиброзного заболевания легких у человека, является работа отечественных ученых Л.В. Курсовой, А.Г. Коноплянникова и др. [121], которые сначала в эксперименте, а затем у пациентов с лучевым пневмонитом и пневмофиброзом (как осложнением лучевой терапии онкологических заболеваний) продемонстрировали стабилизацию клинических, лабораторных, функциональных и перфузионных показателей.
При этом в течение года у больных не отмечено ни одного случая прогрессирования онкопроцесса и не было зафиксированных значимых побочных эффектов, связанных с внутривенной инфузией аутологичных МСК костного мозга [121]. И хотя данное исследование не было рандомизированным и контролированным, и изучало лучевой, а не идиопатический легочный фиброз, оно продемонстрировало как минимум безопасность аллогенных МСК. Результаты первого зарубежного клинического исследования по клеточной терапии ИЛФ было опубликовано в 2013 г. группой греческих авторов [10].
14 пациентам с легким и среднетяжелым нарушением легочной функции эндобронхиально были сделаны 3 инстилляции суспензии аутологичных стромальных (мезенхимальных) клеток жировой ткани в дозе 0,5 млн клеток на кг веса каждая с интервалом в 1 месяц. Было отмечено отсутствие каких-либо серьезных побочных эффектов и стабилизация ФЖЕЛ, диффузионной способности легких и дистанции 6 минутной ходьбы в течение 12 месяцев наблюдения. Спустя 2 года после первого введения клеток все пациенты оставались живы, а продолжение падения функциональных параметров наблюдалось только через 12-24 месяцев от начала терапии. Ни у одного из пациентов не было зафиксировано развития онкологических заболеваний [11]. D Chambers и др. вводили внутривенно 1 или 2 млн/кг веса плацентарных МСК 8 больным с ИЛФ, имеющим ФЖЕЛ более 50%, а DLCO более 25% от должного [12]. Авторы отметили хорошую переносимость клеточной терапии, а также достоверное увеличение дистанции 6 минутной ходьбы через 3 и 6 месяцев после введения клеток. Такие показатели как DLCO и степень фиброза легких по данным КТВР оставались стабильными в течение периода наблюдения, а ФЖЕЛ после небольшого снижения в начале лечения, вернулась к прежнему уровню через 6 мес.
Наконец M Glassberg et al. применили аллогенные МСК костного мозга в дозах 20, 100 или 200 млн. клеток путем однократной внутривенной инфузии 9 больным с ИЛФ [13]. Также как и в других исследованиях серьезных нежелательных событий, связанных с процедурой, не наблюдалось. Двое пациентов умерли в течение 12-месячного периода наблюдения от обострения и прогрессирования заболевания вне связи с проведенной терапией. Что касается оценки эффективности, то авторы наблюдали небольшой прирост в дистанции 6-минутной ходьбы через 36 недель после клеточной инфузии, а общее падение ФЖЕЛ и DLCO за период наблюдения составило 3% и 5,4% соответственно, что в целом ниже, чем, например, в популяции больных ИЛФ, получавших плацебо в исследовании INPULSIS где такой показатель составил 6-6,2% [4]. В целом, все авторы исследований I фазы терапии МСК при ИЛФ отмечали хорошую переносимость и безопасность как аутологичных, так и донорских клеточных препаратов при их сомнительной эффективности, которая требует доказательств в рандомизированных и плацебо-контролированных исследованиях.
Следует отметить, что в первых клинических исследованиях при ИЛФ использовались относительно небольшие дозы МСК (максимально до 200 млн. клеток одному пациенту). По-видимому, это связано с определенными опасениями, касающимися потенциальных профиброзных эффектов стволовых клеток. Известно, что у человека субпопуляция МСК костного мозга - фиброциты, играют определенную роль в развитии интерстициальных патологических процессов в легких. Количество циркулирующих в крови фиброцитов увеличено у больных ИЛФ, повышается в период обострения болезни и служит неблагоприятным прогностическим фактором течения [122].
Фиброциты являются предшественниками фибробластов и их фокусы обнаружены в легких у больных ИЛФ, в отличие от здоровых лиц [123]. Также повышение уровня МСК в жидкости БАЛ является предиктором развития облитерирующего бронхиолита в трансплантированных легких [124]. Еще одной тревогой, связанной с применением аллогенного (донорского) клеточного материала, является возможность иммунологического конфликта, даже несмотря на отсутствие антигенов гистосовместимости у МСК [125].
Наконец, активно обсуждалась возможность неконтролируемого деления трансплантированных клеток в организме реципиента, их потенциальная туморогенность [126]. Однако последнее положение относится к наименее дифференцированным типам СК эмбриональным СК, которые в большинстве стран запрещены для клинических исследований. Поскольку первые клинические исследования МСК при разных видах патологии завершились более 10 лет назад, дальнейшее наблюдение за этими пациентами не выявило повышенной частоты возникновения опухолей среди реципиентов [127]. Вопрос о безопасности высоких доз клеточных препаратов находится в процессе изучения. На сегодняшний день наибольшие дозы МСК, применявшиеся у человека, использованы в клиническом исследовании T. Patila et al у больных с ишемической сердечной недостаточностью, которые вводили трансмиокардиально до 1,35 109 аутологичных стволовых клеток без каких-либо серьезных побочных эффектов [128]. При легочной патологии максимальная доза клеточного препарата составила 10 млн/кг МСК, которые вводились однократно при остром респираторном дисстресс-синдроме. Исследователи не зафиксировали нежелательных явлений связанных с такой дозировкой [129].
Еще одной особенностью клинических исследований клеточных препаратов при ИЛФ является популяция включенных пациентов, у которых снижение главных функциональных параметров легких было легким или умеренным. То же самое относится и к больным, рандомизированным в крупные клинические исследования нинтеданиба и пирфенидона, для них нижней границей ФЖЕЛ был порог 50% от должного [4, 5], кроме того, не учитывалась предшествующая скорость падения функции легких, что не позволило оценить эффекты этих препаратов при тяжелой и быстро прогрессирующей дыхательной недостаточности у больных ИЛФ.
Большинство вопросов, связанных с клеточными технологиями в лечении такого серьезного, прогрессирующего заболевания, как ИЛФ, пока остаются без ответа. Это касается путей доставки клеточным препаратов, доз, кратности введения, механизмов их действия, краткосрочных и долгосрочных эффектов, этических аспектов. Наиболее доказанной является безопасность применения мезенхимальных стромальных клеток из разных источников, которые рассматриваются как основной тип стволовых клеток для клинических исследований. Тем не менее, результаты первых цитированных выше работ дают определенные надежды и в отношении эффективности клеточной терапии, что требует проведения новых хорошо спланированных исследований в данном направлении.