Погоріла Марина Сергіївна Імуномодуляторні влас­тивості екстракту з ембріональних тканин птахів 9-ти діб розвитку за індукованої імунодепресії

Короткий опис

Погоріла Марина Сергіївна, науковий співробітник лабораторії та клінічного відділу молекулярної імунофар- макології ДУ «Інститут мікробіології та імунології імені
І. І. Мечникова НАМН України»: «Імуномодуляторні влас­тивості екстракту з ембріональних тканин птахів 9-ти діб розвитку за індукованої імунодепресії» (03.00.09 - імуно­логія). Спецрада Д 26.001.24 у Київському національному університеті імені Тараса Шевченка

Державна установа «Інститут мікробіології та імунології
імені І.І. Мечникова Національної академії медичних наук України»
Київський національний університет імені Тараса Шевченка
Міністерство освіти і науки України
Кваліфікаційна наукова
праця на правах рукопису
ПОГОРІЛА МАРИНА СЕРГІЇВНА
УДК: 612.017.11:612.014.482.4
ДИСЕРТАЦІЯ
ІМУНОМОДУЛЯТОРНІ ВЛАСТИВОСТІ ЕКСТРАКТУ З ЕМБРІОНАЛЬНИХ
ТКАНИН ПТАХІВ 9-ТИ ДІБ РОЗВИТКУ ЗА ІНДУКОВАНОЇ ІМУНОДЕПРЕСІЇ
03.00.09 – імунологія
Подається на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук
Дисертація містить результати власних досліджень. Використання ідей,
результатів і текстів інших авторів мають посилання на відповідне джерело
________________М.С. Погоріла
Науковий керівник Романова Олена Анатоліївна, кандидат біологічних наук
Київ – 2018

ЗМІСТ
ПЕРЕЛІК УМОВНИХ СКОРОЧЕНЬ 20
ВСТУП 22
РОЗДІЛ 1 ПРОБЛЕМA ІНДУКОВАНОЇ ІМУНОДЕПРЕСІЇ ТА ШЛЯХИ ЇЇ
ПОДОЛАННЯ 28
1.1 Фактори розвитку імунодепресивних станів 28
1.2 Профілактика та корекція імунологічних порушень при депресії
кровотворної та імунної систем. Біопрепарати 36
1.2.1 Імуномодуляторні препарати мікробного походження, що
застосовують для профілактики та корекції імунологічних
порушень 37
1.2.2 Рекомбінантні препарати цитокінів, що застосовують при
корекції дефіцитів гемопоезу та імуногенезу 38
1.2.3 Природні препарати тваринного походження, що знайшли
застосування у корекції порушень гемопоезу та імуногенезу 40
РОЗДІЛ 2 МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ 52
2.1 Характеристика лабораторних тварин 52
2.2 Схеми експериментів 53
2.2.1 Приготування екстракту, контроль якості та стандартизація 53
2.2.2 Визначення деяких конституентів ЕЕТП 9 та його фракцій 54
2.2.3 Порівняння імуномодуляторних властивостей цільного
ЕЕТП 9 та його фракцій 55
2.2.4 Визначення алергізуючих властивостей ЕЕТП 9 55
2.2.5 Індукція радіаційної імунодепресії в експерименті на мишах та
первинна оцінка імунотропних властивостей ЕЕТП 9 57
2.2.5.1 Вплив ЕЕТП 9 на 30-ти добову виживаність мишей за умови
променевого ураження в діапазоні доз 3 – 9 Гр 57
15
2.2.5.2 Вплив ЕЕТП 9 на морфологічну структуру органів імунної
системи при опроміненні мишей в дозі 5 Гр 58
2.2.5.3 Оцінка ефектів ЕЕТП 9 та офіціального препарату «Ербісол»
щодо стану гемо-, імунопоезу та імуногенезу за радіаційноіндукованої імунодепресії в експерименті 59
2.3 Екстракт з ембріональних тканин птахів 9-ти діб розвитку
(ЕЕТП 9) та препарат порівняння 62
2.4 Методи дослідження 63
2.4.1 Контроль якості ЕЕТП 9 63
2.4.2 Визначення концентрації білка в ЕЕТП 9 64
2.4.3 Визначення вмісту FGFb в ЕЕТП 9 65
2.4.4 Фракціонування ЕЕТП 9 65
2.4.5 Дослідження спектру та кількості амінокислот ЕЕТП 9 66
2.4.6 Дослідження спектру та кількості жирних кислот ЕЕТП 9 67
2.4.7 Стандартизація ЕЕТП 9 68
2.4.8 Визначення концентрації IL-2, синтезованого спленоцитами
мишей із циклофосфамідною імунодепресію під впливом
цільного ЕЕПТ 9 та його фракцій in vitro 69
2.4.9 Визначення рівня показників фагоцитарної активності
перитонеальних макрофагів мишей із циклофосфамідною
імунодепресію під впливом цільного ЕЕПТ9 та його фракцій in
vitro 70
2.4.10 Дослідження алергізуючих властивостей ЕЕТП 9 71
2.4.11 Вплив ЕЕТП 9 на показники виживаності мишей, які були
піддані дії γ-випромінювання в діапазоні доз 3 – 9 Гр 72
2.4.11.1 30-ти добова виживаність мишей, що були піддані дії
γ-випромінювання в діапазоні доз 3 – 9 Гр з метою визначення
фактору зміни дози 73
16
2.4.11.2 Оцінка ефективності ЕЕТП 9 за середньою тривалістю життя
мишей при їх опроміненні в дозі LD80-100 (9 Гр) 73
2.4.12 Дослідження морфологічної структури органів імунної системи
мишей 74
2.4.13 Визначення загального числа лейкоцитів периферичної крові
мишей 75
2.4.14 Визначення абсолютного числа формених елементів
периферичної крові мишей 75
2.4.15 Виділення мононуклеарів периферичної крові та визначення
відносного числа популяцій лімфоцитів мишей 75
2.4.16 Визначення абсолютного числа каріоцитів кісткового мозку
мишей 77
2.4.17 Визначення відносного числа сμ
+
sμ
-
та sμ
+ клітин у лімфоїдному
пулі кісткового мозку мишей 77
2.4.18 Визначення відносного числа зрілих Т-лімфоцитів CD90.2+
(Thy 1.2) мишей 78
2.4.19 Визначення абсолютного числа каріоцитів тимусу мишей 79
2.4.20 Визначення абсолютного числа каріоцитів селезінки мишей 79
2.4.21 Визначення вмісту цитокінів в супернатанті каріоцитів
кісткового мозку, культивованих in vitro, у мишей 79
2.4.22 Визначення вмісту цитокінів в сироватці крові мишей 80
2.4.23 Визначення показників фагоцитарної активності нейтрофілів
периферичної крові мишей 81
2.4.24. Визначення здатності нейтрофілів периферичної крові до
відновлення нитросинього тетразолію (НСТ-тест) у мишей 82
2.4.25 Визначення рівня катіонних білків у нейтрофілах периферичної
крові мишей 82
17
2.4.26 Визначення активності лужної фосфатази в нейтрофілах
периферичної крові мишей 83
2.4.27 Визначення активності мієлопероксидази у нейтрофілах
периферичної крові мишей 85
2.4.28 Дослідження функціонального стану Т-лімфоцитів в реакції
бласттрансформації лімфоцитів мишей 86
2.4.29 Дослідження рівня специфічного антитілоутворювання у
відповідь на імунізацію протигрипозною вакциною мишей 86
2.4.30 Дослідження рівня продуктів перекисного окиснення ліпідів в
кістковому мозку мишей 87
2.4.31 Статистичний аналіз отриманих експериментальних даних 88
РОЗДІЛ 3. ХАРАКТЕРИСТИКА ЕЕТП 9 ТА ЗАСТОСУВАННЯ МОДЕЛІ
РАДІАЦІЙНО-ІНДУКОВАНОЇ ІМУНОДЕПРЕСІЇ ДЛЯ ОЦІНКИ ЙОГО
ЕФЕКТИВНОСТІ 89
3.1 Концентрація білка та рівень FGFb в ЕЕТП 9 до та після
кріовпливу 89
3.2 Спектр амінокислот та жирних кислот ЕЕТП 9 90
3.3 Концентрація IL-2, синтезованого спленоцитами та
фагоцитарна активність перитонеальних макрофагів мишей із
циклофосфамідною імунодепресією під впливом цільного
ЕЕПТ 9 та його фракцій in vitro 92
3.4 Оцінка алергізуючих властивостей ЕЕТП 9 96
3.5 Вплив ЕЕТП 9 на показники виживаності мишей із радіаційною
імунодепресією 98
3.6 Гістологічне дослідження органів імунної системи після
введення ЕЕТП 9 мишам із радіаційною імунодепресією 100
3.6.1 Вплив ЕЕТП 9 на морфологію стегнової кістки тварин із
радіаційною імунодепресією 100
18
3.6.2 Вплив ЕЕТП 9 на морфологію селезінки мишей із радіаційною
імунодепресією 105
3.6.3 Вплив ЕЕТП 9 на морфологію тимусу мишей із радіаційною
імунодепресією 109
РОЗДІЛ 4 ВІДНОВЛЕННЯ КЛІТИННОГО СКЛАДУ ОРГАНІВ
ГЕМОПОЕЗУ ТА ІМУНОГЕНЕЗУ ПІД ВПЛИВОМ ЕЕТП 9 У МИШЕЙ
ІЗ РАДІАЦІЙНОЮ ІМУНОДЕПРЕСІЄЮ 112
4.1 Нормалізація абсолютного числа каріоцитів кісткового мозку
мишей із радіаційною імунодепресією під впливом ЕЕТП 9 112
4.2 Відновлення абсолютного числа каріоцитів тимусу мишей із
радіаційною імунодепресією під впливом ЕЕТП 9 116
4.3 Відновлення абсолютного числа каріоцитів селезінки мишей із
радіаційною імунодепресією під впливом ЕЕТП 9 117
4.4 Стан периферичної крові мишей із
радіаційною імунодепресією під впливом ЕЕТП 9 119
4.5 Відновлення числа лімфоцитів та їх субпопуляцій в
периферичній крові мишей із радіаційною імунодепресією під
впливом ЕЕТП 9 127
РОЗДІЛ 5 ВМІСТ ЦИТОКІНІВ, РЕГУЛЯТОРІВ ГЕМОПОЕЗУ ТА
ІМУНОГЕНЕЗУ, У МИШЕЙ ІЗ РАДІАЦІЙНОЮ ІМУНОДЕПРЕСІЄЮ
ПІД ВПЛИВОМ ЕЕТП 9 134
5.1 Вміст цитокінів в супернатанті культивованих in vitro
каріоцитів кісткового мозку у мишей із радіаційною
імунодепресією за дії ЕЕТП 9 134
5.2 Вплив ЕЕТП 9 на вміст цитокінів, регуляторів гемопоезу та
імуногенезу в сироватці крові мишей із радіаційною
імунодепресією 142
19
РОЗДІЛ 6 ВІДНОВЛЕННЯ ФУНКЦІОНАЛЬНОЇ АКТИВНОСТІ
КЛІТИН ІМУННОЇ СИСТЕМИ МИШЕЙ ІЗ РАДІАЦІЙНОЮ
ІМУНОДЕПРЕСІЄЮ ПІД ВПЛИВОМ ЕЕТП 9 152
6.1 Вплив ЕЕТП 9 на відновлення специфічного
антитілоутворювання за імунізації мишей із радіаційною
імунодепресією 152
6.2 Вплив ЕЕТП 9 на відновлення функціональної активності Тлімфоцитів у мишей із радіаційно-індукованою імунодепресією 156
6.3 Вплив ЕЕТП 9 на відновлення функціональної активності
нейтрофілів периферичної крові мишей із радіаційноіндукованою імунодепресією 158
6.4 Рівень продуктів пероксидації ліпідів у кістковому мозку
мишей із індукованою імунодепресію за дії ЕЕТП 9 168
АНАЛІЗ ТА УЗАГАЛЬНЕННЯ РЕЗУЛЬТАТІВ ДОСЛІДЖЕННЯ 172
ВИСНОВКИ 188
СПИСОК ВИКОРИСТАНИХ ДЖЕРЕЛ 189
ДОДАТОК 1 215
20
ПЕРЕЛІК УМОВНИХ СКОРОЧЕНЬ
АЛТ – аланінамінотрансфераза
АСТ – аспартатамінотрансфераза
АТФ – аденозинтрифосфат
АФП – альфа-фетопротеїн
ВІД – вторинний імунодефіцит
ГІМ – гемопоезіндукуюче мікрооточення
ГСК – гемопоетична стовбурова клітина
ГУТ – гіперчутливість уповільненого типу
ДК – дієнові конʼюгати
ДЛЕ – діалізовалий лейкоцитарний екстракт
ЗТ-ПЛР – полімеразна ланцюгова реакція зі зворотною транскрипцією
ІД – імунодефіцит
КМ – кістковий мозок
КУО-ГМ – гранулоцитарно-макрофагальні колонієутворюючі одиниці
ЛПС – ліпополісахарид
МСК – мезенхімальні стовбурові клітини
РБТЛ – реакція бласттрансформації лімфоцитів
РГГА – реакція гальмування гемаглютинації
СІ – система імунітету
СК – стовбурові клітини
СКК – стовбурові кровотворні клітини
СРБ – С-реактивний білок
ТБК – тіобарбітурова кислота
ТК – трієнові конʼюгати
НОР – надосадова рідина
ПОЛ – перекисне окиснення ліпідів
ФГА – фітогемаглютинін
Фі – фагоцитарний індекс
21
Фч – фагоцитарне число
Ig – immunoglobulin – імуноглобулін
IGF1 – insulin-like growth factor 1 – інсуліноподібний фактор росту 1
IFN-γ – interferon-γ – інтерферон-γ
IL – interleukin – інтерлейкін
CSF-1 – colony stimulating factor 1 – фактор стовбурової клітини
SCFR – stem cell factor receptor – рецептор фактора стовбурової клітини
c-Kit – tyrosine-protein kinase Kit – протеїнова тирозинкіназа Kit
EGF – epidermal growth factor – епідермальний фактор росту
FGF – fibroblasts growth factor – фактор росту фібробластів
FGFR – fibroblasts growth factor receptor – рецептор фактор росту фібробластів
Flt3-ligand – Fms-related tyrosine kinase 3 ligand – ліганд Fms-пов’язаної тирозин
кінази 3
G-CSF – granulocyte-colony stimulating factor – гранулоцитарний
колонієстимулювальний фактор
GM-CSF – granulocyte-macrophage colony-stimulating factor – гранулоцитарномакрофагальний колонієстимулювальний фактор
M-CSF – macrophage colony-stimulating factor – макрофагальний
колонієстимулювальний фактор
MIF – macrophage migration inhibitory factor – фактор інгібіції макрофагів
mRNA – messenger RNA – мРНК
NF-κB – nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells – ядерний
фактор – В
PDGF – platelet-derived growth factor – тромбоцитарний фактор росту
SDF-1 – stromal cell-derived factor 1 – рецептор хемоатрактанту
TGF-β – transforming growth factor beta – трансформуючий фактор росту β
TNF – tumor necrosis factor – фактор некрозу пухлини
22
ВСТУП
Актуальність теми. Вторинні (набуті) імунодефіцити – широко
розповсюджені імунодепресивні стани, спричинені застосуванням лікарських
засобів з імуносупресорною активністю (цитостатики, кортикостероїди, опіоїдні
анальгетики тощо), крововтратами (в результаті травми, опіку або хірургічного
втручання), довготривалими інфекційними (гепатити, герпетичні інфекції тощо)
та асептичними (цукровий діабет, ревматоїдний артрит тощо) запальними
захворюваннями, ультрафіолетовим випромінюванням, іонізуючою радіацією,
порушеннями білкового харчування, нестачею в раціоні мікроелементів, таких як
цинк та ін [1–5]. Зниження загальної імунної реактивності внаслідок набутого
імунодефіциту ініціює низку патологічних станів, що являють собою суттєву
загрозу для якості та тривалості життя людини [6, 7]. Наслідками
скомпрометованої імунної реактивності є підвищена захворюваність на
онкологічну патологію, інфекційні захворювання, метаболічні хвороби та багато
інших [8–10].
Імунодепресивні стани різноманітного ґенезу частіше за все асоціюються з
пошкодженням функціонування гемопоетичної системи, відповідальної за
диференціювання та вихід у циркуляцію формених елементів крові [11].
Порушення медулярного гемопоезу супроводжує пригнічення імунної
реактивності з віком [12], а також вторинний імунодефіцит, викликаний
ВІЛ-інфекцією [13]. Обов’язковою і вирішальною умовою лікування індукованих
порушень імунної реактивності є відновлення супресованого кровотворення, яке
залежить від глибини субпопуляційного спустошення та/або ступеня
функціонального ушкодження гемопоетичних і лімфоїдних елементів [14].
Для відновлення супресованої імунної реактивності використовують замісну
терапію або неспецифічні імуномодулятори [15, 16]. Зважаючи на те, що на
вторинні імунодефіцитні стани страждає значна частина людей у всьому світі
пошук та розробка засобів для відновлення супресованої імунної реактивності є
23
актуальним завданням сучасної імунології, імунореабілітації та
імунобіотехнології [17].
На сьогоднішній день серед засобів із відновлювальними ефектами щодо
гемо- та імунопоезу вирізняються препарати з ембріональних тканин тваринного
походження, які є складними комплексами біохімічно активних сполук з широким
спектром біологічної дії, до складу яких входять білки, пептиди, вільні
амінокислоти, жирні кислоти, РНК, ДНК, цитокіни (зокрема, інтерлейкін-3,
гранулоцитарний-, макрофагальний- та гранулоцитарно-макрофагальний
колонієстимулювальні фактори, лектини тощо) [18, 19]. Препарати з
ембріональних тканин здатні активувати проліферацію та диференціювання
клітин імунної системи, прискорювати процеси регенерації [20], посилювати
фагоцитарні властивості лейкоцитів, впливати на інтегральні метаболічні процеси,
справляти антистресовий та антитоксичний ефекти [21]. У число таких препаратів
входять екстракти тканин ембріонів птахів, у тому числі 8-9 діб розвитку, оскільки
у цьому періоді у них накопичується максимальна кількість різних ростових та
диференціювальних факторів (зокрема, G-CSF, IL-1, IL-3, FGF) [22]. Екстракти
курячих ембріонів широко застосовуються як джерело факторів диференціювання
для культивування in vitro нейрональних, нейроепітеліальних та ембріональних
стовбурових клітин [23]. У медичній практиці екстракти курячих ембріонів
застосовуються для відновлення зниженої імунної реактивності у
післяпологовому періоді [18]. На тваринних моделях показана здатність екстрактів
курячих ембріонів стимулювати репаративні імунні реакції [24]. Однак,
незважаючи на зареєстрований широкий спектр імуномодуляторних властивостей,
вплив екстрактів курячих ембріонів на супресовані гемо-, імунопоез та імуногенез
залишається практично недосліджений.
Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота
виконана у відповідності до науково-дослідної теми Державної установи
«Інститут мікробіології та імунології ім. І.І. Мечникова Національної академії
медичних наук України» «Експериментальне обґрунтування тактики корекції
24
порушень антиінфекційної резистентності на моделі радіаційно-індукованого
імунодефіциту» (№ д/р 0106U003263).
Мета і задачі дослідження. Метою роботи було дослідити вплив екстракту
з ембріональних тканин птахів 9 діб розвитку (ЕЕТП 9) на процеси гемо-,
імунопоезу та імуногенезу за індукованої імунодепресії.
Для досягнення мети було поставлено такі задачі:
1. Визначити концентрацію білка та FGFb у складі ЕЕТП 9 до та після
кріовпливу.
2. Порівняти вплив ЕЕТП 9 та його фракцій на синтез IL-2
спленоцитами та фагоцитарну активність перитонеальних макрофагів мишей із
циклофосфамідною імунодепресією in vitro.
3. Провести оцінку впливу ЕЕТП 9 на виживаність мишей умовах
радіаційного впливу в діапазоні доз 3 – 9 Гр.
4. Дослідити вплив ЕЕТП 9 на морфологічний стан кісткового мозку,
тимусу та селезінки у тварин із радіаційною імунодепресією (5 Гр).
5. Провести порівняльну оцінку імуномодуляторних властивостей
ЕЕТП 9 та офіцинального препарату «Ербісол» на моделі радіаційної
імунодепресії.
Об’єкт дослідження – імуномодуляторні властивості ЕЕТП 9, щодо гемо-,
імунопоезу та імуногенезу в умовах індукованої імунодепресії.
Предмет дослідження – кількісні та функціональні характеристики
каріоцитів органів гемопоезу та імунокомпетентних клітин периферичної крові за
дії ЕЕТП 9 в умовах індукованої імунодепресії.
Методи дослідження – біохімічні, гематологічні, гістологічні, імунологічні,
мікробіологічні, статистичні.
Наукова новизна отриманих результатів. Доповнено наукові дані щодо
реконститутивних властивостей препаратів з ембріональних тканин тваринного
походження. Вперше показано здатність ЕЕТП 9 до швидкого і повноцінного
відновлення морфологічної структури органів імунної системи (кісткового мозку,
тимусу, селезінки), фенотипового складу лімфоїдного компартменту кісткового
25
мозку та зниження рівня продуктів пероксидації ліпідів у мієлокаріоцитах,
відновлення популяційного і субпопуляційного складу та функціональної
активності лейкоцитів периферичної крові за умов індукованої імунодепресії.
Доведено перевагу ЕЕТП 9 над офіцинальним ембріональним препаратом
«Ербісол», яка полягає у скороченні терміну відновлення процесів кровотворення
та функціонального стану клітин вродженого та адаптивного імунітету у тварин з
індукованою імунодепресією.
Розширено існуючі уявлення щодо впливу препаратів з ембріональних
тканин тваринного походження на синтез і секрецію цитокінів. Встановлено
здатність ЕЕТП 9 стимулювати продукцію мієлокаріоцитами цитокінів, що
регулюють гемопоез (G-CSF, Flt3-ligand та IL-6) у кістковому мозку. Виявлено
підвищення сироваткових рівнів цитокінів – регуляторів імунних реакцій (IL-1β,
IL-4 та IL-6) за впливу ЕЕТП 9 в ранні строки після індукції імунодепресії без
явища їх пролонгованої гіперпродукції в динаміці.
Отримано нові дані про спектр амінокислот та жирних кислот ЕЕТП 9.
Вперше визначено кількісний вміст фактору росту фібробластів 2 (FGFb) у складі
ЕЕТП 9.
Практичне значення одержаних результатів. Проведені дослідження
надають експериментальне обґрунтування доцільності застосування екстракту з
ембріональних тканин птахів 9-ти діб розвитку з метою прискореного відновлення
гемопоезу та функціонального потенціалу імунної системи з наданням йому
повноцінного і стабільного характеру в умовах індукованого імунодефіциту.
Результати дослідження можуть слугувати обґрунтуванням для клінічного
випробування ефективності використання ЕЕТП 9 за набутих розладів гемопоезу
та імуногенезу.
За матеріалами дисертації створено «Технологію отримання екстракту з
ембріонів курей, що володіє імуномодулюючими властивостями» та отримано
патент на корисну модель «Отримання екстракту з ембріонів курей», № 85646 від
25.11.2013 р.
26
Наукові положення дисертації впроваджені у навчальний курс кафедри
загальної і клінічної імунології та алергології Харківського національного
університету ім. В.Н. Каразіна МОН України та кафедри клінічної мікробіології та
імунології Харківської медичної академії післядипломної освіти МОЗ України.
Особистий внесок здобувача. Автором особисто проведено інформаційний
пошук, проаналізовано фахові наукові публікації за темою дисертації,
аргументовано робочу гіпотезу дослідження, проведено експериментальні
дослідження та статистичний аналіз одержаних результатів, проведено їх
узагальнення з подальшим оформленням у вигляді наукових публікацій,
сформульовано висновки, написано та оформлено усі розділи дисертації.
Визначення мети, задач дослідження, розробка методичних підходів, розробка
дизайну дослідження та формулювання висновків здійснено спільно з науковим
керівником. Автор вдячний за допомогу у реалізації експериментальної роботи із
залученням γ-випромінювання д.м.н., проф. Сімоновій-Пушкар Л.І. (ДУ «Інститут
медичної радіології ім. С.П. Григор’єва НАМН України», м. Харків), за допомогу
в дослідженні метаболічної активності нейтрофільних гранулоцитів д.б.н.,
проф. Перському Є.Є. (Харківський національний університет ім. В.Н. Каразіна),
за допомогу в розробці екстракту з ембріональних тканин птахів д.б.н.,
проф. Жегунову Г.Ф. (Харківська зооветеринарна академія), за допомогу в оцінці
біохімічного складу екстракту з ембріональних тканин птахів науковому
співробітнику Шаповалову С.О. (Випробувальний центр Інституту тваринництва
НААН України).
Здобувач вдячний за допомогу у проведенні досліджень колегам, співучасть
яких у виконанні роботи відмічена у спільних публікаціях.
Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертації
оприлюднено і обговорено на: научно-практической конференции с
международным участием «Актуальные вопросы биологии, экологии, медицины и
фармакології» (м. Дніпропетровськ, 2013 р.); III Международной научной
конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Фундаментальные и
прикладные исследования в биологии» (г. Донецк, 2014 г.); міжнародній науково-
27
практичній конференцiї «Теоретичні та практичні аспекти розвитку сучасної
медицини» (м. Львів, 2014 р.); міжнародній науково-практичній конференцiї
«Медична наука та практика: актуальні питання взаємодії» (м. Київ, 2014 р.);
міжнародній науково-практичній конференцiї «Сучасні тенденції у медичних та
фармацевтичних науках» (м. Київ, 2014 р.); міжнародній науково-практичній
конференції «Пріоритети сучасної медицини: теорія і практика» (м. Одеса,
2015 р.); науково-практичній конференції з міжнародною участю «Щорічні
терапевтичні читання: від досліджень до реалій клінічної практики ХХІ століття»
присвяченій пам’яті академіка Л.Т. Малої (м. Харків, 2015 р.); науково-практичній
конференції за участю міжнародних спеціалістів «Актуальні питання боротьби з
інфекційними захворюваннями», присвяченій 170-й річниці з дня народження
І.І. Мечникова, (м. Харків, 2015 р.); міжнародній науково-практичній
конференції «Проблеми та стан розвитку медичної науки та практики в Україні»,
(м. Дніпро, 2016 р.).
Публікації. За результатами дослідження опубліковано 23 наукові праці,
серед яких 1 – патент на корисну модель, 9 статей у вітчизняних фахових наукових
виданнях, затверджених переліком МОН України (з них 1 – у виданні, що входить
до міжнародної науко метричної бази даних SCOPUS), 12 – тез доповідей,
1 технологія.
Структура і обсяг дисертації. Дисертаційна робота складається зі вступу,
огляду літератури, розділу матеріали і методи дослідження, 4 розділів результатів
власних досліджень, розділу аналізу та узагальнення результатів досліджень,
висновків, списку використаних літературних джерел, який містить 228 посилань,
з яких 128 – латиницею, 100 – кирилицею). Матеріали дисертаційної роботи
викладені на 220 сторінках (з яких основна частина займає 169 сторінок),
ілюстровані 36 рисунками, 12 таблицями та 7 схемами

Список літератури

ВИСНОВКИ
У дисертаційній роботі наведено теоретичне узагальнення та представлено
вирішення одного з сучасних наукових питань імунології – пошуку нових засобів
корекції вторинної імунної недостатності. Встановлено здатність екстракту з
ембріональних тканин птахів 9-ти діб розвитку відновлювати гемо-, імунопоез та
імуногенез у тварин з радіаційною імунодепресією. Результати дисертаційного
дослідження експериментально обґрунтовують доцільність розробки
профілактичних та лікувальних засобів відновлення недостатності гемопоезу та
імунної реактивності на основі екстракту з курячих ембріонів 9-ти діб розвитку.
1. ЕЕТП 9 містить 0,77±0,05 мг/мл білка та 120±6,8 нг/мл FGFb. Зберігання
ЕЕТП 9 у рідкому азоті не впливає статистично достовірно на зазначені
показники.
2. Цільний ЕЕТП 9 справляє більш виразний стимулювальний вплив in vitro,
ніж окремі гідрофільна або гідрофобна фракції: посилює у 2,3 раза синтез ІL-2
спленоцитами, в 1,7 раза – фагоцитарний індекс перитонеальних макрофагів
тварин з імуносупресією in vitro.
3. Одноразове застосування ЕЕТП 9 мишам в дозі 0,1 мг/кг за добу перед
дією γ-випромінювання зрушує LD50/30 з 6 Гр до 7 Гр. Фактор зміни дози для ЕЕТП
9 за одноразового застосування складає 1,16. Застосування ЕЕТП 9 забезпечує
38,1 % виживаність мишей протягом 30-ти діб після дії γ-випромінювання в дозі
LD80-100 (9 Гр) порівняно з групою контролю, де спостерігалася 100 % летальність.
4. Відновлення морфологічного складу кісткового мозку, тимусу, селезінки
за імунодепресії під впливом ЕЕТП 9 характеризується активацією процесів
морфогенезу тканин органів, проліферації та диференціювання їх клітинних
елементів у порівнянні зі спонтанною реконституцією. Структура
кістковомозкової тканини набуває фізіологічного стану на 14 добу дослідження.
189
5. Повне відновлення абсолютного числа клітин кісткового мозку та
популяційного складу його лімфоїдного компартменту у тварин з імунодепресією
під дією ЕЕТП 9 відбувається на 14 добу, тимоцитів та каріоцитів селезінки – на
21 добу, що випереджає реконституцію зазначених показників (р≤0,05) під
впливом препарату порівняння «Ербісол». Рівень продуктів ПОЛ в клітинах
кісткового мозку за впливу ЕЕТП 9 досягає фізіологічних значень на 14 добу,
поряд з його перевищенням на 30 % на цей термін у групі, що отримувала
«Ербісол».
6. У тварин з імунодепресією, що отримували ЕЕТП 9, відновлення
абсолютного числа лейкоцитів, лімфоцитів та гранулоцитів периферичної крові
відбувається 14 добу, що випереджає реконституцію (р<0,05) аналогічних
показників у групі порівняння на 27 %, 57 % та 26 % відповідно. Нормалізація
відносного числа Т-лімфоцитів та їх субпопуляцій у групах із застосуванням
ЕЕТП 9 та «Ербісол» відбувається одночасно (на 7 добу), частки B-лімфоцитів –
на 14 добу.
7. Мітоген-активована проліферативна активність Т-лімфоцитів у тварин з
імунодепресією, що отримували ЕЕТП 9, відновлюється на 21 добу і перевершує
аналогічний показник у тварин, що отримували препарат «Ербісол», у 1,5 рази.
Фагоцитарний індекс та фагоцитарне число нейтрофілів досягають фізіологічного
рівня у тварин із імунодепресією за впливу ЕЕТП 9 та «Ербісол» на 14 добу та 21
добу відповідно, у той час як аналогічні показники у контрольних тварин з
імунодепресією були в 1,6 та 1,2 раза нижчими за норму. Поствакцинальні титри
антитіл, продукованих В-лімфоцитами у тварин з імунодепресією, що отримували
ЕЕТП 9, на 14 та 30 добу після імунізації перевищували аналогічні показники у
тварин, яким застосовували «Ербісол», в 1,8 та 1,3 раза відповідно.
8. ЕЕТП 9 модулює продукцію гемопоетичних цитокінів протягом 1 доби
після індукції імунодепресії: концентрація G-CSF зростає у 257 – 506 разів, IL-6 –
у 1,5 – 25 разів, Flt3-ligand знижується в 1,1 – 1,6 раза порівняно з контролем,
переважаючи ефекти від застосування «Ербісол». Нормалізація рівня IL-6 та Flt3-
190
ligand за впливу ЕЕТП 9 настає на 3 добу, G-CSF – на 7 добу, випереджаючи
реконституцію фізіологічних рівнів означених цитокінів за використання
препарату «Ербісол».
9. Застосування ЕЕТП 9 супроводжується збільшенням сироваткових рівнів
IL-1β, IL-6 та IL-4 у мишей впродовж 1 доби після індукції радіаційної
імунодепресії, достовірно підвищуючи їх рівні порівняно з контролем у 127,0 –
341,0, 2,0 – 350,0 та 3,0 – 60,0 разів відповідно, що значно перевищує ефекти
препарату «Ербісол». Під впливом ЕЕТП 9 нормалізація рівнів IL-1β, IL-6 та IL-4
зареєстрована на 7 добу дослідження, тоді як за застосування препарату «Ербісол»
нормалізація синтезу всіх означених цитокінів не спостерігається до закінчення
періоду дослідження