БІОХІМІЧНІ ТА МЕМБРАННІ МЕХАНІЗМИ УШКОДЖЕННЯ МІОКАРДУ ЗА ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЇ СЕРЦЕВОЇ НЕДОСТАТНОСТІ ТА ЇЇ КОРЕКЦІЇ ФІЗІОЛОГІЧНО АКТИВНИМИ СПОЛУКАМИ МЕТАБОЛІТНОЇ ДІЇ

summary

     Об`єкти та моделі дослідження. Основні серії експерименталь-них досліджень, які представлені в дисертації,  проведені на дорослих білих щурах лінії Вістар та кролях, які утримувались у віварії Націо-нального медичного університету імені О.О.Богомольця. Утримання та досліди на тваринах проводили відповідно до правил „Європей-ської конвенції захисту хребетних тварин, яких використовують в експериментальних та інших наукових цілях” (Страсбург, 1986).

     Експериментальну серцеву недостатність моделювали в дослі-дах на щурах-самцях  шляхом щотиж­невого  внутрішньом'язового вве-дення рубоміцину гідрохлориду в дозі 5 мг на кг маси тіла протягом 5 тижнів. Застосовували такі препарати: Рубоміцину гідрохлорид ("Мосмедпрепарати" ім. Л.Я.Карпова), Даунорубіцин (рубоміцину гідрохлорид) виробництва АТ Ферейн, РФ) та Doxorubicin hydrochloride ("Фармація та Апджон", Італія).

     З метою корекції біохімічних та структурно-функціональних змін в міокарді  тварин з СН було вивчено більше 60 сполук з потен-ційною кардіотропною активністю, переважна більшість яких були похідними одного з головних субстратів циклу трикарбонових кислот  сукцинату та попередника в синтезі нікотинамідних нуклеотидів НАД⁺ і НАДФ⁺ амінокислоти триптофану.  Серед досліджених ФАС найбільш песпективними виявилися  сполука “Суфан” і краун-ефір похідне урацилу  “Карбіцил” та “Диол”, дослідженню біохімічних та мембранотропних механізмів дії яких були присвячені експеримен-тальні досліджень, представлені в  дисертації:  Суфан – дикалієва сіль N-сукциніл-D,L-триптофану, синтезована в Інституті ендокринної па-тології АМН України - патент України 33864, МКУ А 6Іу 3/08, А 61 К 31/395);  Карбіцил – 1,3-біс(2-гідроксиетил)урацил, синтезований в Інституті органічної хімії НАН України - патент Російської Федерації № 2055581 от 10.03.1996; Диол – 1,2-ди(бета-гідроксиетилокси)бензол, синтезований в Інституті органічної хімії НАН України - патент Укра-їни № 95010133 від 17.03.1998.

      В якості препаратів порівняння  використовувалися такі референт-ні препарати: β-адреноміметик добутамін, глікозидний кардіотонік строфантин-К  Мембранотропні властивості нових ФАС кардіотоніч-ної дії в дослідах in vitro порівнювали з такими агоністів та антаго-ністів кальцію різних класів: фенілалкіламіну добутаміну, похідних дигідропіридину: ніфедипіну та сполуки  ВАУ-К-8644. 

     Біохімічні методи дослідження метаболітів та ферментів. Визначення вмісту в тканинах міокарду та печінки окиснених (НАД⁺, НАДФ⁺) та відновлених форм (НАДН та НАДФН) нікотинамідних коферментів проводили флуорометричним методом, активності НАД-гідролізуючих ферментів  вимірювали за швидкістю гідролізу НАД⁺  (Телепнева В.И., Исаева И.В., 1967).

     Визначення вмісту аденілових нуклеотидів проводили електро-форетичним методом з послідуючою спектрофотометрією при довжині хвилі 260 та 290 нм. Вміст креатинфосфату (КрФ) оцінювали як різницю між загальним і вільним креатином,  який визначали спектрофотометрично при довжині хвилі 525 нм, глікогену - за допомогою антронового реактиву, активність креатинфосфатокінази  (КФК) – за утворенням вільного креатину при інкубації з КрФ (В.Н.Орехович, 1977; Ю.И.Губский, Ю.В.Хмелевский, 1985).

     Вивчення жирнокислотного (ЖК) складу та вмісту холестеролу проводили методом газохроматографічного аналізу (Гичка С.Г., 1998) після екстракції ліпідів за Фолчем (Прохорова М.И., 1982). Кількісну оцінку окремих  ЖК проводили шляхом нормування площин і визна-чення частки кислот у відсотках. Кількісну оцінку рівня холестеролу проводили методом абсолютної калібровки за допомогою стандарт-ного розчину холестеролу з концентрацією 1 мг/мл.

    Вивчення активності ліпопереокислення (ЛПО) та АО-активності досліджуваних ФАС проводили на основі  кількісного визначення на-копичення малонового диальдегіду (∆МДА) як продукту вільноради-кального перекисного окислення поліненасичених ЖК мембранних фосфоліпідів (Ю.А.Владимиров, А.И.Арчаков, 1972). Реакції ВРО вивчалися в ферментативній (НАДФН-залежній) та неферментатив-ній системах; зупинка реакції досягалася внесенням в пробу суміші трихлороцтової кислоти з 10^–2 М ЕДТА (Ю.І.Губський, 1985).

     Визначення активності глутатіонової антиоксидантної (АО) систе-ми в тканинах – вміст відновленого глутатіону (G-SH) та  активностей ферментів глутатіонового циклу – глутатіонпероксидази та глутатіон-редуктази здійснювали за Г.А.Кругликовою, Ц.М.Штутман (1976). 

     Антирадикальні активності досліджуваних ФАС оцінювали за кінетикою  взаємодії із стабільним радикалом 2,2-дифеніл-1-пікрил-гідразином (ДФПГ) при 520 нм на реєструючому спектрофотометрі Schimadzu MPS-5000  (Ю.І.Губський,Є.Л.Левицький т.і., 2002).

     Вивчення біохімічних показників сироватки крові  щурів здійсню-вали шляхом визначення активностей ферментів аланінамінотранс-ферази (АЛТ), аспартатамінотрансферази (АСТ), лужної фосфатази за допомогою аналізатора для біохімічних та імунохімічних досліджень "Stat Fax 1904 Plus" та набору реактивів "Global Biomarketing Group".      Вміст загального білку, альбуміну, креатиніну, глюкози, неорганіч-ного фосфату (Р_н), триацилгліцеролів (ТГ), загального холестеролу та холестеролу ЛПВЩ в сироватці крові визначали загальноприйнятими біохімічними методами (Прохорова М.И., 1982; Базарнова М.А., 1994).

    Біофізичні та квантово-хімічні методи дослідження.

Вивчення  змін біофізичних  параметрів мембранних структур за дії ФАС.  З метою вивчення біофізичних механізмів взаємодії кардіотроп-них та вазотропних ФАС з біомембранами проводили реєстрацію УФ-спектрів поглинання на спектрометрі Shimadzu МРS-5000, мікрокало-риметричні дослідження на мікрокалориметрі ЛКБ-2107 (Швеція) та  флуоресцентне зондування мембран за допомогою спектрофлуометру “Hitachi” МРF-4 (Японія). Здатність досліджуваних ФАС спричиняти структурні зміни в біомембранах, властивостях поверхні або в гли-бинних їх ділянках вивчали  за допомогою флуоресцентних зондів (1-аніліно-нафталіно-8-сульфонат - АНС, пірен, флуорескамін) та мето-дом гасіння білкової флуоресценції дифузійним гасником акриламі-дом (Г.Е.Добрецов, 1989). В якості моделей біомембран використову-вали ліпосоми з  ФХ та кардіоліпіну.

     Вірогідність індуктивно-резонансного переносу енергії (ІРПЕ) в системі диполь – індукований диполь між донором електронів (мемб-ранним білком) та акцептором, що характеризує стан білок-ліпідних взаємодій в біомембранах, оцінювали в мікросомальних суспензіях печінки за допомогою флуоресцентного зонду пірену.

     Дані серії експериментів виконувалися на базі відділу біохімічної фармакології Інституту фармакології та токсикології АМН України (зав. відділу – член-кор. АМН України проф. Ю.І.Губський) за мето-дичної участі ст. наук. співр. канд. хім. наук Г.Г.Горюшко.

 Дослідження поверхнево-активних властивостей ФАС проводилися на модельних моношарових мембранах, сформованих з азолектину, ФХ, фосфатидилсерину (ФС) та модельної суміші, що включала також альбумін сироватки людини і холестерол.

     Взаємодію ФАС з ліпідними моношарами реєстрували через зміни форми ізотерм стискання в координатах "поверхневий тиск /площа на молекулу ліпіду”, що реєструвались терезами Вільгельмі. Обраху-вання змін параметрів моношару, зокрема вільної енергії на границі розподілу ΔG та її складових проводили згідно  Si-sheng Feng et al.

Вивчення змін біофізичних властивостей плазматичних мембран кар-діоміоцитів за дії суфану проводили за допомогою АНС та пірену.   Полярність місць локалізації пірену та ступінь ексимеризації зонду оцінювали за методами (Г.Е.Добрецов, 1989; ЮІ.Губський, Є.Л.Леви-цький, Г.Г.Горюшко т.і., 1998).

 Дослідження комплексоутворення  суфану з біолігандами  - ФХ, холе-стеролом, L-амінокислотами, АМФ, АДФ, АТФ, НАДФ, НАДН, іншими біолігандами та іонами металів) проводили  спектрофотометр-ричним титрування на спектрофотометрі "SPECORD M-40". 

Квантово-хімічні методи  розрахунку  структури та властивостей ФАС.  Значення квантово-хімічних та фізико-хімічних параметрів  молекул та аніонів ФАС розраховували за допомогою комп’ютер-них програм НуреrChem 6.0, ChemOffice-2004, MOPAC 2000. Визна-чалися  енергії вищої заповненої та нижчої незаповненої молекуля-рних орбіталей, розподіл електронів за енергетичними рівнями енергетичні параметри комплексів ФАС з біолігандами (загальна енергія, енергія зв’язування, ентальпія утворення комплексів).

     Вивчення впливу досліджуваних ФАС на кардіогемодинаміку нар-котизованих тварин, дослідження реакції системної і регіонарної гемодинаміки ненаркотизованих щурів на  дію ФАС, визначення сер-цевого викиду і регіонарного кровообігу здійснювалися загально-прийнятими фізіологічними та фармакологічними методами. Попе-редніми дослідженнями була встановлена виразлива кардіотонічна дія вивчаємих метаболітних препаратів суфану та карбіцилу  як за умов вивчення кардіодинаміки на експериментальних тваринах – щурах та кролях, так і при вивченні їх фармакологічних ефектів на ізольованих папілярних м`язах щурів.

     Статистичний аналіз одержаних даних проводили з використанням стандартного критерію ״t״ Стьюдента для незв′язаних виборок. Кореляційний аналіз здійснювали за допомогою програми BIOSTAT (версія 3.03) з розрахунком коефіцієнтів кореляції (r) та їх статистич-ної вірогідності (р) (Минцер О.П. и др., 1991).

ОСНОВНІ РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА  ОБГОВОРЕННЯ

Біоенергетичні процеси та ушкодження мембранних структур міокарду за експериментальної СН. Порушення біоенергетичних процесів в клітинах міокарду за умов експериментальної СН були ви-явлені в багатьох дослідженнях (Фролькис Р.А., Воронков Г.С., 1987; Ивашкин В.Т., 2004; Чекман І.С., Мохорт М.А., Горчакова Н.О. т.і., 2001). Разом з тим, детальних досліджень клітинної біоенергетики в міокарді за умов експериментального моделювання СН введенням кардіотоксичного антибіотику рубоміцину, раніше не проводилося, що і стало за мету цього розділу наших досліджень.       

     Проведеними дослідженнями було встановлено, що введення  щу-рам рубоміцину гідрохлориду призводить до суттєвого порушення реакцій біологічного окислення та постачання енергетичних субст-ратів в кардіоміоцитах, про що свідчать негативні зміни в концент-рації та катаболізмі нікотинамідних коферментів НАД⁺ і НАДФ⁺,  різке падіння вмісту КрФ та глікогену (в 2,81 рази та 2,29 рази, відповідно) та суттєве  (на  75,3%) зниження  активності  КФК (Таблиця 1).

     На тлі ушкодження окислювальних процесів та зниження вмісту  в кардіоміоцитах КрФ, що є резервом для відновлення макроергічних фосфатів в результаті функціонування креатинфосфокіназній реакції (Сакс В.А. т.і., 1988, 1989), в міокарді щурів спостерігалося значне зниження потенціалу фосфорилювання та фонду АТФ, необхідного для здійснення скорочувальної функції актоміозинових комплексів міофібрил (Таблиця 2).