БИОЛОГО-ВИРУСОЛОГИЧЕСКОЕ ОБОСНОВАНИЕ АНТИПРОТЕАЗНОЙ ТЕРАПИИ ГРИППА (экспериментальное исследование)

summary

       Матеріали і методи досліджень. Використовували віруси грипу А/РR/8/34 (Н1N1), A/Aichi (H3N2), А/СССР/90/77 (H1N1), А (Екстра Х-31), А/WSN/33 (H1N1), А/Філ/2/82 (H3N2), AO/32 (H0N1), вирощені на 9-ти денних курячих ембріонах і В штам PR-109, отриманий рекомбінацією вірусів В/Lее/40 і В/СССР/100/83. Штами вірусів отримані в НДІ вірусології ім. І.Д. Івановського АМН Росії, штам АО/32 (HON1) – в НДІ грипу Санкт-Петербургу, Росія. У роботі використовували безпородних білих мишей та лінії «Ваlв/c», курячі ембріони, перещеплювану культуру клітин МДСК та білих щурів.

    З метою вивчення біолого-вірусологічного обґрунтування антипротеїназної терапії грипу були використані методики: вірусологічні, біохімічні, імунологічні, молекулярно-біологічні, радіоізотопні.

   Для вивчення природи протеолітичної активності, асоційованої з вірусом грипу, використовували вірус грипу штам АО/32 (HON1) з інфекційним титром 7 lg ЕІД _50/0,2  і ГА-1:125, яким інфікували 10-11 добові курячі ембріони у об’ємі 0,2 мл розведеного до 10^-3 інфекційного матеріалу.

Концентрацію та очищення вірусу грипу проводили методами центрифугування у градієнті сахарози (15% - 60%) в ультрацентрифузі VAK – 602, у бакет-роторі при 28000 хв.^-1   протягом чотирьох годин. Очищений та концентрований вірус грипу піддавали подальшому реультрацентрифугуванню при 33000 хв.^-1 у роторі SV-40, ультрацентрифузі “Spinko” протягом 3-х годин. Одержані препарати використовували для препаративного очищення електрофорезом у 7,5% поліакріламідного гелю у відновлюючих та у не відновлюючих умовах по Лаверу (Laver W.G. 1971, 1972).

  З метою вивчення ролі трипсиноподібних протеїназ та їх інгібіторів у процесі розвитку грипозної інфекції використовували вірус грипу A/PR/8/34 (H1N1), адаптований до легеневої тканини білих мишей.

У роботу брали білих безпородних мишей вагою 7-9 г і 16-17 г. Інфікування тварин проводили інтраназально під легким ефірним наркозом у об’ємі 0,05 мл  розведеного до 10^-1 інфекційного матеріалу, що відповідало інфекційній дозі 2,5^-2 ЛД₅₀. Ця доза забезпечувала 100% летальність тварин на п’яту добу після інфікування. Тварин забивали і забирали легені та кров (по 5 мишей у кожній групі) через 15 хв.; 30 хв.; 1 год.; 6 год.; 24 год.; 48 год.;  72 год.; 96 год.; 120 год.; 148 год. після інфікування. Паралельно, в ті ж терміни, забивали і забирали легені і кров у здорових мишей. У сироватці крові та легенях визначали інфекційну, протеїназну та інгібуючу активність.

   Виділення та очищення трипсиноподібної протеїнази проводили з легенів здорових та інфікованих білих мишей лінії “Ваlв/c” вагою 16-18 г. Легені розрізали ножицями, потім гомогенізували у ступці, обробляли ультразвуком при 18 кГц по 75 с на приборі Soniprep 150 MSE (уся робота проводилась на холоді). Гомогенат центрифугували при 10000 об/хв. на протязі 1 години на центрифузі RC-5В при температурі +4⁰С. До осаду додавали 1% тритон Х-100 і залишали до ранку у холоди льнику. Надосадочну рідину (супернатант I) заморожували. На наступний день осад знову обробляли ультразвуком і центрифугували при вищеназваних параметрах. Супернатанти I та II поєднували і використовували у подальшому для очищення. Очищення діалізованого матеріалу проводили методом іонообмінної хроматографії на ДЕАЕ целюлозі – 32;52 на приборі LКВ-2023, Minicololal (Broma). Колонка була висотою 18 см з діаметром 1,75 см. Ступінь очищення контролювали по білку та активності протеїнази. Фракції, які мали високі показники протеїнази, додатково очищували діалізом проти води, знесолюванням на сефадексах G-15, G-50 та електрофорезом у 12,5% ПААГі.

   Трипсиноподібні протеїнази використовували для вивчення їх фізико-хімічних властивостей (оптимум рН, молекулярна маса, вплив на них інігібіторів трипсину: овомукоїда, триеліну, ЕАКК та інігібітору з ячменю) і для вивчення впливу їх на розвиток вірусу грипу в перещеплюваній культурі клітин МДСК та на розщеплення гемаглютиніну  вірусу грипу.

       Виділення інгібітору трипсиноподібних протеїназ проводили тим же методом, що застосовували для виділення протеїназ. Очищення інгібітору проводили за допомогою хроматографії на ДЕАЕ-целюлозі, гельфільтрацією на сефадексах G-15 і G-50, а також за допомогою афінної хроматографії на трипсин-сефарозі 4В. В останньому випадку трипсин ковалентно зв’язували з BrCl-сефарозою 4В по загальноприйнятій методиці. Афінну хроматографію проводили у 0,05 М трис-HCl буфері рН 7,6. Десорбцію проводили послідовно буферними розчинами, які містили 1 М NaCl, 8 М речовину      та розчин 0,2 М KCl – HCl pH 2,0. Інгібітор трипсиноподібних протеїназ у фракціях визначали за ступенем гальмування гідролізу БАПНА (-бензоіл-аргинін-р-нітроанілід) кристалічним трипсином. Кількість білку в препаратах протеїну та інгібітору визначали методом Лоурі, а у хроматографічних фракціях – спекрофотометрично по поглинанню при 750 нм.

  Молекулярну масу інгібітора визначали за допомогою рідинної високоефективної хроматографії високого тиску на приборі FPSC фірми Pharmacia (Швеція) з використанням колонки НР-10/30 та смоли Superose 6. У якості маркерів молекулярної маси були використані декстран голубий (2000000 Да), ферітін (400000 Да), каталаза (240000 Да), БСА (76000 Да), овальбумін (45000 Да), хімотрипсіноген А (25000 Да) та міоглобулін (17800 Да).

   Інгібітор трипсиноподібних протеїназ використовували для визначення його лікувальних властивостей у білих мишей лінії ІСR вагою 17-18 г, попередньо інфікованих смертельною (2,5^–2 ЛД₅₀) дозою вірусу грипу. Кожна миша за курс лікування одержувала 0,126 мкг інгібітору. Інгібітор трипсиноподібної протеїнази також використовували для вивчення його дії на розвиток вірусу грипу в курячих ембріонах та дію його на протеолітичну активність протеїнази, виділеної з легенів білих мишей.

   Для одержання гіперімунних антипротеїназних сироваток використовували білих щурів вагою 170-200 г лінії Wistar. Імунізацію білих щурів проводили чотирьохкратно з повним ад’ювантом Фрейнда та з кожною ізоформою трипсиноподібних протеїназ раз на тиждень. Кожний щур одержував по 890 одиниць протеїнази та 560 одиниць загального білку. Тотальний забір крові для одержання гіперімунних сироваток проводили на сьому добу після останньої імунізації. Одержані антипротеїназні сироватки використовували для вивчення впливу їх на виживання білих мишей, які заздалегідь були інфіковані смертельною дозою (2,5^–2 ЛД₅₀) вірусу грипу. Нейтралізуючі якості гіперімунних сироваток вивчали на 3-х добовій перещеплюваній культурі клітин МДСК. Наявність антитіл визначали у РЗК та методом зустрічного імуноелектрофорезу.

   Статистичну обробку отриманих даних проводили за програмами Microsoft Exсel.

      Протеолітична активність, асоційована з вірусом грипу.  Як показали наші дослідження,  процес очищення і концентрування вірусу грипу методами центрифугування (рис.1) не звільняв вірус грипу від протеїназної активності. В процесі очищення, паралельно із зменшенням білку, зростала питома протеолітична активність з розрахунку на 1 мг білка. Центрифугування осадів через 20% шар сахарози також не звільняло вірус грипу від протеїназної активності. Аналогічне явище виявлено і при очищенні вірусу в ступінчастому градієнті сахарози при 28000 об/хв. протягом чотирьох годин (табл.1). Як видно з результатів досліджень, протеїназа розділилася на декілька ізоформ. Високі показники протеолітичної активності визначалися в зоні 11–15 % сахарози, в 42–49%, 52–55 %. Основна частина протеолітичної активності була зосереджена в зонах, де локалізувався практично увесь очищений вірус.

  Таким чином, протеїназа чітко розділилася на декілька активних компонентів, що свідчить про її гетерогенність. Ці ізоформи мали неоднакову молекулярну масу, оскільки під дією сильних відцентрових сил відбувалося осадження (седиментація) молекул розчиненого білку.

  Реультрацентрифугування фракції, яка містила 38 – 43% концентрацію сахарози і де локалізувався весь очищений вірус при 33000 об/хв. ^-1 в роторі SV –40 ультрацентрифуги “Spinko” протягом трьох годин, не звільняло вірус грипу від протеолітичної активності.

         Для збереження протеолітичної активності электрофорез в ПААГ проводили в невідновлюваних умовах. Аналіз фракцій показав, що асоційована спочатку з вірусом грипу протеїназа чітко розділилася на 7 –9 фракцій, які мали високу протеолітичну активність і різний електричний заряд. Ці дані свідчать про значну гетерогенність ферменту трипсиноподібної протеїнази. В контрольних дослідах було виявлено подібний ферментний профіль в елюатах поліакриламідного гелю. Різниця полягала в тому, що питома протеолітична активність у всіх фракціях з розрахунку на мг білку різко поступалася протеолітичній активності елюатів фракцій очищеного вірусу грипу, а також в тому, що протеїназа з нормальних тканин швидше генерувалася (рис. 2).

       Оскільки при очищенні і концентрації вірусу грипу не вдалося звільнити вірус грипу від протеолітичної активності, належало розв'язати питання про походження протеїнази, асоційованої з вірусом: вона клітинна чи вірусіндукована? Як показали дослідження (табл. 2), під дією імунних щурячих сироваток протеїназа нейтралізувалась як у фракціях 11-15 % сахарози, де завжди локалізувались клітинні білки, так і у фракціях 38-49 % сахарози, де містився вірус. Гемаглютинуюча активність при цьому не тільки збереглася, але, навіть, і збільшилася. Під дією нормальної щурячої сироватки протеїназа також нейтралізувалась.