Бокшан О.Я. Виявлення та діагностика карантинних бактеріозів: опіку плодових та бурої гнилі картоплі

summary

ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ

В огляді літератури, який складається з 3-х підрозділів, висвітлено географію, цикл розвитку, симптоми, біологію та методи ідентифікації опіку плодових та бурої гнилі картоплі. Описано моделі прогнозу появи та розвитку опіку плодових. Приведені дані про ензим-індикацію та серологічні методи досліджень бактерій.

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Моніторинг плодових насаджень на виявлення бактеріального опіку проводили в Закарпатській області (Ужгородський, Берегівський, Виноградівський, Іршавський райони) та Чернівецькій області (Придністровська науково - дослідна станція Інституту садівництва УААН, Сторожинецький, Кіцманський райони) згідно існуючих методик (Воронкова, 1974). Визначення  ступеню ураження бактеріальним опіком різних сортів груші та яблуні в плодових насадженнях Придністровської науково-дослідної станції Інституту садівництва УААН та в приватних садах Закарпатської області проводили за загальноприйнятою методикою (Дементьева, 1970). Мікробіологічний аналіз зразків патологічного матеріалу, вивчення патогенних, фізіологічних та серологічних властивостей ізолятів проводили у відповідності із методами діагностики збудників бактеріозів (Гвоздяк, Матвеева та ін., 1987; Бельтюкова та ін., 1968; Кирай та ін., 1974). Як контроль при проведенні бактеріологічного аналізу, використовували колекційний штам E.amylovora 9057 отриманий з колекції живих культур відділу фітопатогенних бактерій Інституту мікробіології та вірусології
НАНУ.

Імунні сироватки до E.amylovora, які використовували в серологічних реакціях, були отримані нами шляхом імунізації кролів бактеріями E.amylovora штам 9057 за різними схемами імунізації (Бельтюкова, 1968; Schroder, 1978; ). Абсорбцію родоспецифічних антитіл імунної до E.amylovora сироватки проводили шляхом додавання до неї однакового об’єму суміші культур E.carоtovora і P. agglomerans у фізіологічному розчині з наступним відділенням аглютинату шляхом центрифугування.

 Для прогнозування появи та розвитку опіку плодових використовували моделі Maryblyt model,  Cougarblight – версія 2000 (Celsius),  Billing’s integrated system та Billing’s original system, дані метеорологічних умов Ужгородського та Берегівського районів за 2001-2003 рр., проводили спостереження за фенологічним станом дерев яблуні сортів Айдаред, Джонатан, Старкримсон, Голденспур.

 Моніторинг гнилі картоплі в сховищах та на посадках проводили протягом 2000-2002 рр. в Закарпатській області в Ужгородському, Мукачівському, Перечинському та Воловецькому районах згідно існуючих методик. Ідентифікацію збудників проводили за методиками як це описано в роботах: Кирай та ін (1974); French (1995). 

Вивчення характеристики збудників гнилей картоплі проводили на колекційних штамах R.solanacearum 9049, 9080, 9081, E.carotovora 8982, C.sepedonicum 7757, P.fluorescens 8573, які були отримані з відділу фітопатогенних бактерій Інституту мікробіології і вірусології ім. академіка Д.К.Заболотного НАНУ.

Вивчення культуральних властивостей R. solanacearum, E.carotovora, C.sepedonicum та P.fluorescens проводили на картопляному середовищі, середовищі Кельмана  з 2,3,5 тетразолій хлоридом, середовищі Кінга В (Бельтюкова, 1968).

Вивчення спектру рослин, здатних уражуватись бактеріями R. solanacearum, проводили шляхом штучного інфікування листків та пагонів картоплі, томатів, перцю, тютюну, баклажанів бактеріальною суспензією 10⁸ кл/мл методом ін’єкції та нанесенням суспензії на пошкоджені місця. Облік ураженості рослин проводили за шкалою, запропонованою Aley та ін. (1994).

Диференціацію бактеріозів картоплі без виділення збудника проводили на основі реакції з КОН та тестів на уреазу (Cowan, 1974) і оксидазу (Lloyd,1978). Вивчення протеолітичної активності бактерій за допомогою фотоплівки проводили за методикою, описаною Кузнєцовою (1989).

Для прискорення ензим-індикації фітопатогенних бактерій виготовляли з фільтрувального паперу індикаторні диски діаметром 0,5 мм, які насичували розчином цукрів та багатоатомних спиртів різних концентрацій (1%, 5% та 10%) і вносили в стерильні (0,4% та 0,04%) розчини індикатора при температурі 18⁰С та 25⁰С протягом 0,5, 1 та 24 годин. Оцінку біохімічної активності бактерій за допомогою паперових індикаторних дисків проводили мікрометодом. У пробірку з 0,3 мл стерильного фізіологічного розчину (рН 7,2-7,4) вносили петлю добової агарової культури мікроба, а потім додавали відповідний паперовий індикаторний диск. Облік проводили  через 2, 3 та 24  години  інкубації при температурі  28⁰ С за характером зміни кольору індикатора. Контролем були диски, занурені в стерильний фізіологічний розчин без внесення бактерій та класичний метод вивчення біохімічної активності за допомогою кольорового ряду. 

При вивченні способу засвоєння глюкози за допомогою паперових індикаторних дисків в дві пробірки з 0,3 мл фізіологічного розчину (рН 7,2) та петлею добової культури вносили диски і одну пробірку заливали стерильним вазеліновим маслом. Обліки проводили через 3-5 годин інкубації при температурі 28⁰С. Контролем були аналогічні пробірки без внесення маси культури бактерій, а також пробірки з 1% агаром з глюкозою та індикатором і ідентичною культурою, одна з яких заливалась мінеральним маслом. Інкубацію проводили протягом 3 діб при температурі 28⁰С.

Каталазну активність у бактерій визначали за методикою, запропонованою Варвашевич з співавторами (1989).

Постановку реакції кільцепреципітації без виділення бактерій в чисту культуру здійснювали за методикою Ізраїльського (1967), але кількість досліджуваного матеріалу було збільшено в 10 раз і додавали 0,5% сахарози в фізіологічному розчині, ставили в термостат на 3 год. при 28⁰С.

Реакцію непрямої гемаглютинації здійснювали за методом Рицаря з виготовленим нами еритроцитарним діагностикумом (Бокшан, 2002).

Реакцію непрямої гемаглютинації без виділення збудника в чисту культуру здійснювали з екстрактом патологічного матеріалу, підготовленого так, як і для постановки реакції кільцепреципітації.

БАКТЕРІАЛЬНИЙ ОПІК ПЛОДОВИХ

Моніторинг плодових культур на виявлення бактеріального опіку в Закарпатській та Чернівецькій областях України. Протягом 8 років (1996-2003 рр.) проведено вибірковий моніторинг плодових садів на виявлення опіку плодових в 20 населених пунктах Закарпатської та 10 населених пунктах Чернівецької областей. Вперше в Чернівецькій області бактеріальний опік плодових був виявлений в 1997 році, а в Закарпатській області – в 2003 році. До цього часу на території України ця хвороба не реєструвалася.

Спостереження за симптомами хвороби показали відсутність характерного молочно-білого ексудату, але інші ознаки (гачкоподібний згин верхівок молодих пагонів, зміна кольору листя на груші до чорного, а на яблуні до коричневого, розтріскування кори з відшаруванням епідермісу, муміфікація плодів груші та яблуні) вказували на подібність захворювання до бактеріального опіку плодових. Хвороба на  груші охоплювала всю верхівкову частину дерева і поступово спускалась на нижні гілки, а на деревах яблуні спостерігали лише часткове ураження окремих скелетних гілок.