Черевата Т.М. Розробка і оптимізація прийомів клонального мікророзмноження для виробництва садивного матеріалу винограду

summary

Застосування  методу клонального мікророзмноження в рослинництві

(огляд літератури)

Наведена і  узагальнена інформація про стан досліджень з питань розмноження винограду in vitro. На основі аналізу робіт вітчизняних та іноземних авторів визначені недоліки технологічних етапів клонального мікророзмноження, обґрунтована необхідність і визначені напрямки оптимізації процесу мікроклонування. Актуальність даної проблеми і необхідність розробки прийомів для підвищення ефективності виробництва садивного матеріалу винограду зумовили проведення досліджень, результати яких представлені в даній дисертаційній роботі.

Об’єкти, матеріали та методика  проведення досліджень

Робота виконувалась в лабораторії культури in vitro, теплицях Центру клонової селекції ННЦ “Інститут виноградарства і виноробства ім.В.Є.Таїрова” та його дослідних ділянках протягом 1994 - 2005рр. у  відповідності до  програм  НДР.

При проведенні досліджень використовували методичні рекомендації           Р.Г. Бутенко (1964), П.Я.Голодриги, В.А.Зленко, Л.А.Чекмарева, Б.А.Левенко (1986). Дослідження проводили на клонах столових, технічних  і  підщепних  сортів винограду.

В  якості  вихідного  матеріалу  для  введення    в  культуру  in  vitro  використовували  зелені  пагони  маточних  кущів винограду на протязі вегетації. Визначення оптимального типу вихідного матеріалу  проводили шляхом порівняння  регенераційної здатності експлантів пагонів кущів,  які культивуються на клонодослідній ділянці,  в теплицях Центру клонової селекції, а також  пагонів, одержаних пророщуванням визрілої лози в зимовий період. Кущі-донори  проходили систематичне  тестування на відсутність вірусної і бактеріальної  інфекції. 

         Стерилізацію  експлантів,  введення  їх  в    культуру in  vitro,  а також  всі  роботи,  пов'язані  з  розмноженням in  vitro,  здійснювали  в  асептичних  умовах    ламінарних боксів, обладнаних  пилозахисними  камерами  зі  стерильною  подачею повітря типу СМ - 5 і ультрафіолетовими опромінювачами  типу УТД- 2. Для визначення режиму  стерилізації  вихідного  матеріалу при введенні в культуру in vitro були  випробувані   розчини сульфохлорантину (0,2% ; 0,5%), гіпохлориту  кальцію ( 2% ; 5%),  та 70⁰  і  60⁰ етанол  за  умов різної експозиції.

Оптимальний тип ініціальних експлантів визначали, порівнюючи особливості розвитку мікрочубуків  в залежності від їх розміру  -    0,3 – 0,7 см;  0,8 – 1,0 см ; 1,2 - 1,5 см та місцезнаходження  на  вихідному  пагоні  - на  рівні 1, 2, 3, 4, 5, 6- го вузлів  від  верхівки  пагону.

Рослини   культивували in vitro в  боксах  при  сталих  фізичних    параметрах: t⁰ = + 27 ⁰ С, освітленості  3 000  лк, 16 - годинному  фотоперіоді;  вологості  повітря - 70 %. Для культивування мікроклонів використовували стакани діаметром 40 мм, висотою 150 мм. Об’єм поживного середовища складав 20 мл,  іонітного субстрату – 45-50см³.    

Розробку оптимального  поживного середовища здійснювали шляхом модифікації складу середовища Ніча і Ніч - вмісту біологічно-активних речовин, вуглеводів,  мінеральних солей. В якості додаткових джерел застосовували азотнокислий кальцій в концентрації 240  мг/л;   360 мг/л; 480 мг/л і комплекс   амінокислот (мг/л) :  гліцин -   4,0,   цистін -  2,5,  L - глутамінова кислота - 7,0,    L- аланін – 5,0.

Розробку  поживного  субстрату для  культивування  винограду  in vitro  проводили спільно з інститутом  фізіко - органічної  хімії  АН  Білорусі (м. Мінськ). Досліджували вплив   рівня    рН  -  6,0;   7,0;   8,0  та  величини  реалізованої ємкості  аніоніту субстрату E - 1,5; 2,5; 3,0; 3,5; 4,5 мг-екв/г на розвиток  мікроклонів.

         Дослідження залежності  морфогенезу винограду in vitro  від спектрального   складу  світла   проводили за умов освітлення культуральних боксів фітолампами

 ЛР  - 12,5  -  з  випроміненням  в синій  частині  спектру (430 нм) - 12,5% ,  в  червоній  (625  нм ) - 87,5%  та  ЛР - 25  - з  випроміненням в синій  частині  спектру–25%,  червоній - 75%.  Роботу проводено у співпраці з відділом люмінофорів Інституту  Гіредмед  (м. Москва.).

Адаптацію мікроклонів винограду до умов in  vivo здійснювали шляхом поєднання етапів мікрочубукування, вирощування та адаптації мікроклонів. Для визначення  оптимального  типу  поживного  субстрату  для  адаптації вивчали  особливості  розвитку рослин  на  суміші  іонітних  субстратів  Біона : цеоліт                   ( фракції 0,5-1,0;  2,0-3,0; 4,0-5,0 мм )  у  співвідношенні  1 : 1; 3 : 1;  3 : 2.

В  ході  досліджень проводили обліки за показниками: регенераційна здатність (%); приживлюваність (%) ;   період  проліферації бруньки (діб) ;  період  ризогенезу (діб);  довжина  пагона (см); кількість  вузлів  на  пагоні (шт);  кількість коренів (шт); довжина коренів (см ), площа листової поверхні (см²), діаметр пагону (мм ), визрівання пагону ( % ).

         В  кожному  варінті  досліду  використовували  по  20  експлантів.  Досліди  виконували  в  п'ятикратній  повторності.

Дорощування адаптованих мікроклонів до параметрів стандартних саджанців здійснювали в теплиці на  цеолітовому субстраті та в польових умовах. Біометричні показники розвитку саджанців визначали за методикою С.О.Мельника та В.І.  Щигловської (1957).

Статистична  обробка  одержаних  експериментальних  даних  проведена з застосуванням дисперсійного, регресійного та кореляційного аналізу  на 95 %  рівні  вірогідності  за  методикою  Б.А.Доспєхова (1985), з використанням  комп'ютерних    програм Microsoft Excel, Аgrobase.

Оптимізація відбору вихідного матеріалу для  клонального

мікророзмноження  винограду

Порівняльне вивчення особливостей матеріалу різного походження встановило, що експланти пагонів, відібраних з кущів, які ростуть в польових умовах, при введенні в культуру in  vitro виявляють  високий рівень контамінації – 57,9 %  і  низьку регенераційну здатність – 26,4 %. При використанні пагонів з теплиці і з пророщеної лози інфекція  проявлялась  лише  у 12,5 % експлантів.  За рівнем  регенераційної  здатності – 71,8 % - експланти  з  пагонів  тепличного  походження істотно перевищували   інші варіанти - на 6,7 %. В подальшому експланти  пагонів  кущів  винограду, які  культивуються  в  теплиці, відрізнялись   активними морфогенними   процесами, період  формування мікроклонів  був коротшим  на  5,2 – 7,0 діб. Виявлено, що найвищий регенераційний потенціал мають молоді пагони винограду в фазі активного росту.  Періодичний відбір верхівок пагонів стимулював розвиток пасинків, які в подальшому  були   донорами ініціальних експлантів.