ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНЕ ОБҐРУНТУВАННЯ ІМУНОФЕРМЕНТНОЇ ДІАГНОСТИКИ ТРИХІНЕЛЬОЗУ ТВАРИН

summary

Матеріали і методи досліджень. Експериментальну частину роботи, апробацію та виробничу перевірку результатів досліджень проводили упродовж 2003–2007 років у науковій лабораторії кафедри паразитології та фармакології Білоцерківського національного аграрного університету, кафедри вірусології, мікробіології та біотехнології Національного аграрного університету, у відділі паразитології Державного науково-дослідного інституту з лабораторної діагностики та ветеринарно-санітарної експертизи, а також у відділах паразитології державних лабораторій ветеринарної медицини ряду областей України (Київської, Миколаївської, Полтавської, Івано-Франківської, Хмельницької).

Матеріалом для досліджень були: штам Тrichinella spiralis; зразки м’язової тканини та сироватки крові, отримані від експериментально заражених трихінелами свиней, собак, коней; сироватки крові тварин із господарств ряду областей України (Київської, Миколаївської, Полтавської, Івано-Франківської, Хмельницької); позитивні й негативні на трихінельоз референс-сироватки Міжнародного епізоотичного бюро, екскреторно-секреторний антиген із личинок Т. spiralis, а також кон’югати імуноферментні на основі рекомбінантних білка А золотистого стафілокока та стрептококового білка G, кон’югованих з пероксидазою хрону. Рекомбінантні білки А та G люб’язно надані нам Рибальченком Д.Ю., аспірантом кафедри мікробіології, вірусології та біотехнології Національного аграрного університету.

Експериментальне зараження трьох свиней, двох коней та трьох собак здійснювали личинками Т. spiralis. Тварин заражали аліментарно фаршем з м’язів щурів, що містили личинки трихінел. Інвазійна доза складала – для свиней №1, №2 та №3 відповідно 30000, 10000 та 5000 екз. лич. на тварину; для коней №1 та №2 – 70000 та 40000 відповідно, для собак №1, №2 та №3 – по 30000 екз. лич. Т. spiralis.

Від дослідних тварин відбирали зразки сироваток крові на 7, 14, 21, 28, 35 та 42-у добу після зараження. Після закінчення експерименту проводили еутаназію тварин, а від їх туш відбирали зразки м’язової тканини діафрагми, масетерів, кореня язика. Кількість личинок трихінел у пробах м’язової тканини підраховували у 48 зрізах методом компресорної трихінелоскопії та в 1 г м’язової тканини після перетравлювання у штучному шлунковому соці (метод пепсинізації). Сироватки крові від експериментально заражених тварин досліджували в ІФА з використанням розробленої нами тест-системи.

У ході розробки тест-системи для діагностики трихінельозу тварин виготовляли специфічні антигени, підбирали імуноферментний кон’югат, хромоген, оптимальні розчини для розведення сироваток крові та кон’югату, а також визначали оптимальне розведення антигену, сироваток крові й кон’югату для проведення реакції. Випробували два типи антигенів: соматичний та екскреторно-секреторний. Соматичний антиген готували з екстракту личинок T. spiralis першої стадії за методикою L.R. Melcher (1943) у нашій модифікації. Екскреторно-сектеторний антиген отримували культивуванням личинок           T. spiralis першої стадії in vitro на живильному середовищі (Gamble H.R., 2000).

Білковий склад отриманих антигенів визначали шляхом проведення електрофорезу в поліакриламідному гелі за методом U.K. Laemmlі (1970), специфічність – постановкою імуноблоту з позитивними і негативними сироватками крові тварин за методикою, описаною H. Towbin та ін. (1979).

Для постановки імуноблоту і твердофазного імуноферментного аналізу готували імуноферментний кон’югат на основі рекомбінантних білка G Streptococcus spp. та білка А Staphylococcus aureus, які кон’югували з пероксидазою хрону перйодатним методом за P. K. Nakane та A. Kawaoi (1974). Специфічність отриманих кон’югатів перевіряли в ІФА.

Розчинами для розведення сироваток крові під час постановки ІФА слугували фосфатно-сольові буфери, що містили 0,05% Твіну 20 та 3% БСА або 0,5% желатини, чи 5% сухого знежиреного молока. Оптимальне розведення антигену, сироваток крові та імуноферментного кон’югату для проведення ІФА визначали шляхом титрування.

На завершальному етапі розробки тест-системи здійснювали її випробування на внутрішньовиробничій панелі позитивних і негативних сироваток крові тварин та панелі сироваток Державного науково-контрольного інституту біотехнології і штамів мікроорганізмів (ДНКІБШМ). Після цього розраховували чутливість та специфічність розробленого діагностикуму.

У ході розробки модифікованої тест системи для діагностики трихінельозу тварин на основі дот-ІФА як імуносорбент використовували полістиролові гребінці (мікропориста мембрана) з 9–12 зубцями. Кожен зубець сенсибілізували екскреторно-секреторним антигеном T. spiralis у попередньо підібраній титруванням концентрації.

Для інкубації з сироватками крові, кон’югатом, розчином хромогену, а також для промивання зубців гребінця як ванночки використовували стандартні бактеріологічні мікротитрувальні планшети на 96 луночок. У лунки ряду А ванночки для інкубації вносили зразки сироваток крові в розчині для розведення, у лунки ряду С – робочий розчин імуноферментного кон’югату (білка G, кон’югованого з пероксидазою хрону). Оптимальне розведення сироваток крові та імуноферментного кон’югату визначали титруванням. У лунки рядів В, D, E вносили розчин для промивання зубців гребінця, ряду F – розчин хромогену – аміноетилкарбазолу (АЕК) або тетраметилбензидину преципітувального (ТМВ-Precip).

Для проведення аналізу гребінець по черзі вставляли у ряд А–F з інкубацією на кожному етапі протягом певного часу та за певної температури. Час та температуру інкубації гребінця на кожному етапі підбирали емпірично. Для зупинки реакції гребінець переносили у ряд Е. Облік реакції проводили візуально. Зразки сироваток крові тварин вважали позитивними у разі появи забарвлення на відповідному зубці, негативними – за відсутності такого забарвлення.

Моніторингові дослідження на трихінельоз тварин в Україні проводили згідно з рекомендаціями Міжнародного епізоотичного бюро (OIE, 2004). З цією метою була розроблена „Програма моніторингових досліджень на трихінельоз на 2005–2006 роки“, відповідно до якої у 2006 р. досліджено 166443 свині, 716 коней, 484 кабанів, 55 собак, 75 котів, 1377 лисиць, 39 вовків, 5 борсуків. Дослідження проводили за допомогою розробленої нами тест-системи „Trichineliso test AB“ (ТУУ 24.4-23524007-729:2005) та „Набору діагностичного для ідентифікації личинок Trichinellа spiralis методом перетравлення проб м’язів“(ТУУ 24.4-23524007-058:2005).

Цифрові матеріали результатів досліджень обробляли статистичними методами з використання табличного процесора Microsoft Excel for Windows.