ФАСЦІОЛЬОЗ ВЕЛИКОЇ РОГАТОЇ ХУДОБИ (ЦИТОГЕНЕТИЧНІ ДОСЛІДЖЕННЯ ЗА ВПЛИВУ ФАСЦІОЛОЦИДНИХ ПРЕПАРАТІВ)

summary

Загальна методика та основні методи дослідження. Робота виконана упродовж 2003–2008 рр. Гельмінтологічні, копроовоскопічні, гематологічні, цитогенетичні та цитологічні дослідження виконали на кафедрі паразитології та іхтіопатології Львівського національного університету ветеринарної медицини та біотехнологій імені С.З. Гжицького.

Вивчення поширення фасціольозу великої рогатої худоби у Тернопільській, Івано-Франківській та Львівській областях здійснювали у 2000–2004 pp. шляхом аналізу даних звітної документації обласних державних лабораторій ветеринарної медицини і відділів виробничого та ветеринарного контролю. Аналізуючи звіти, брали до уваги відомості про поголів’я тварин, відсоток уражених тварин відносно загальної кількості обстежених, кліматичні умови регіону.

Польові досліди проводили шляхом виявлення біотопів малого ставковика на берегах водоймищ та вологих ділянках пасовищ у с. Острів Сокальського району та в околицях м. Самбір Львівської області за методикою В.І. Здуна (1960).

Проводили цитогенетичні та морфологічні дослідження соматичних клітин печінкових лімфовузлів (тканина із паракортикальної зони) та селезінки (частина білої пульпи) клінічно здорових та спонтанно заражених фасціолами тварин (Астауров Б.Л., 1974). Виготовляли повітряно-крапельні препарати (Соболта А.Г., 2007). Фарбували лактатоцтоорсеїном (Астафьев Б.А., 1989) та рутинно за Романовським-Гімза. Всього виготовили 213 препаратів. Підрахунок, аналіз клітин і висновки про їх мітотичну активність та частоту геномної мінливості (метафази з хромосомами біля полюсів, тригрупові метафази, нерівні метафази та гігантські клітини) і хромосомної мінливості (змінені анафази, анафази з мостами, анафази з фрагментами і мостами) проводили за кількістю вивчених 500 клітин різної етіології із кожного органа, що знаходились на різних стадіях мітозу (профази, метафази, анафази та телофази) за методами Г.Г. Тинякова, 1960, А.П. Дибана, 1969, І.А. Алова, 1972, визначали індекс мітотичної активності (Алов І.А., 1975).

Експериментальні та клінічні дослідження на здоровій, а також спонтанно зараженій фасціолами великій рогатій худобі 20-місячного та 3-річного віку проводили у господарствах: ПАФ ”Острів“ (Сокальського району) і ДПДГ ”Миклашів“ (Пустомитівського району) Львівської області. Для досліджень використовували препарати комбітрем, бронтел 10 % та бровальзен-емульсію, виготовлені НВФ ”Бровафарма“ (Україна).

У базових господарствах формували групи контрольних і дослідних тварин за принципом аналогів, які знаходились в однакових умовах утримання, годівлі та догляду. Матеріалом для досліджень слугували проби фекалій та крові з яремної вени, які відбирали у всіх тварин на початку досліджень та через 15 і 35 діб перед вранішньою годівлею. Проби фекалій (5 грамів) із прямої кишки досліджували на наявність яєць в 1 г гельмінтоовоскопічним методом М.Ш. Акбаєва (2000). Всього було проведено 678 копроовоскопічних досліджень від 226-ти тварин. З крові виготовляли мазки, фіксували метанолом та фарбували за Романовським-Гімза. Всього виготовили 724 препарати. Для дослідження впливу F. hepatica на стабільність геному великої рогатої худоби та вивчення можливої мутагенної дії вищезгаданих фасціолоцидів на геном клінічно здорових тварин використали мікроядерний тест (Schmid W., 1973, 1975). У мазках крові підраховували кількість еритроцитів з мікроядрами і виражали у (проміллє) ‰.

Поряд із цими дослідженнями, проводили вивчення терапевтичної ефективності вищезгаданих антигельмінтиків.

При вивченні впливу фасціолоцидних препаратів на статевозрілих
F. hepatica скористалися тестом паралічу гельмінтів (Черепанов А.А.,
Кармалієв Р.С., 1991). Статевозрілих паразитів відбирали з жовчних ходів забитої великої рогатої худоби, їх вік визначали за наявністю сформованих органів (сім’яників, матки, жовткових клітин) з урахуванням їх розміру та кольору. Поміщали по 20 екземплярів на 24 години у склянки ємністю по 500 мл із 6–10-ти серіями розведень антигельмінтиків на розчині Хедон-Флейга (Ханбегян Р.А., 1975) у відповідності до терапевтичних доз препаратів: (комбітрем – 0,1; 0,05; 0,025; 0,012; 0,006; 0,003; 0,0015; 0,00075; 0,00037; 0,00018 мг/см³; бронтел 10 % – 1,2; 0,6; 0,3; 0,1; 0,07 і 0,03 мг/см³; бровальзен – 0,15; 0,075; 0,037; 0,018; 0,0093; 0,0046; 0,0023; 0,0011; 0,00058; 0,00029 мг/см³). Одна склянка була контролем. Нерозчинні у воді фасціолоциди – комбітрем та бровальзен розводили етиловим спиртом: до 10 мг препарату додавали 0,16 мл етилового спирту (Бенедіктов І.І., 1982). Кожні 2 години проводили контроль життєздатності фасціол у склянках з різним розведенням антигельмінтиків за допомогою механічного подразника (вколювання препарувальною голкою). Паразитів диференціювали на живих та паралізованих (без ознак зовнішнього реагування). Всього було піддано дослідженню 1174 екземплярів фасціол.

З метою визначення біологічної резистентності яєць до фасціолоцидів, використали авторський метод виходу личинок із яєць гельмінта, розроблений на кафедрі паразитології та іхтіопатології ЛНУВМ та БТ імені С.З. Гжицького та запатентований як ”Спосіб оцінки ефективності фасціоліцидів іn vitro (Деклараційний патент України на винахід (корисну модель) № 7771, Україна МПК 7 А01К67/00). Застосовували антигельмінтики комбітрем, бронтел 10 % та бровальзен. З жовчі інвазованої фасціолами великої рогатої худоби отримували яйця F. hepatica. Готували 6–10 серій розведень антигельмінтиків: комбітрему, бронтелу 10 % та бровальзену, як це описано у попередній методиці. Яйця культивували у чашках Петрі з додаванням 2 мл розчину антигельмінтика та по
2 мл суспензії яєць гельмінта (в 1 мл було не менше 150 яєць). Ще в одну чашку Петрі вносили суспензію яєць без препарату, яка була контролем. Культивування яєць здійснювали впродовж 16–18 діб у термостаті за температури 20 ºС
з періодичною аерацією. Диференційне визначення відсотка личинок, які вийшли, відносно до контрольної групи, проводили на 100 яєць. Для вірогідності дослідження проводили у п’яти повторностях. Кількісним показником чутливості до дії препаратів слугувала концентрація препарату, яка забезпечувала загибель 50 % яєць гельмінтів (LC 50) (Черепанов А.А., Кармалієв Р.С., 1991).

Сперматогенез у статевозрілих F. hepatica вивчали з використанням цитогенетичних методів досліджень (Графодатський А.С., 1988). Фасціол гіпотонізували у 0,85 %-му розчині натрію цитрату 20 хв за температури 37 ^о С. Фіксували у метанол-оцтовій суміші (3:1) 12 годин. Гельмінтів фарбували у
2 %-му розчині ацетокарміну 3–4 доби (Астауров Б.Л., 1974). Повітряно-сушені та тимчасові тиснені тотальні препарати виготовляли за відомими методами
(Дибан А.П., 1969; Пенькова Р.А., 1973; Тєрская Е.Р., 1974; Астаф’єв Б.А., 1989) у деяких модифікаціях (Соболта А.Г., 2004). Всього виготовлено 868 препаратів. Оцінку результатів з вивчення клітин на стадіях сперматогенного циклу
F. hepatica проводили шляхом виявлення та диференціації первинних, вторинних та третинних сперматогоніїв, сперматоцитів першого та другого порядків, а також сперматид і сперміїв (Stitt A.W. 1990, Соболта А.Г., 2004).

Вивчали мутагенну дію фасціолоцидних препаратів на репродуктивну систему F. hepatica. Поміщали по 20 екз. фасціол у стерильні посудини
ємністю 500 мл з розчинами комбітрему та бронтелу 10 % за наближених рівнів у крові на 24 години, як це описано у попередній методиці. Одна посудина без антигельмінтиків була контролем. Гіпотонізували, фіксували та виготовляли тимчасові тиснені тотальні препарати (Дибан А.П., 1969; Пенькова Р.А., 1973; Астаф’єв Б.А., 1989), які оцінювали методом порівняння кожні 6, 12 та 24 години нормальних і патологічних клітин сперматогенного циклу (сперматоцитів, сперматид, сперміїв) та клітин мейотичного циклу у кожної фасціоли, зміни у яких були викликані дією фасціолоцидів. При вивченні мейозу скористалися методиками А. Мюнцинга, 1967, В.С. Баранова, 1968, Л.К. Рамайя, 1969, А.П. Дибана, 1969, У. Вельша, 1976, Н.Н. Мамаєва, 1980, П. Гетза, 1980,
Л.Ф. Курила, 1980, 1989, З.П. Паушевої, 1988. Критерієм для порівняння слугували клітини оброблених та необроблених фасціолоцидами гельмінтів у стадії профази 1 та метафази 1 мейозу: лептотени, зиготени, пахітени та диплотени. Зміни полягали у морфологічно змінених статевих клітин мейозу, що проявлялось порушенням їх нормальної структури, набуханням та розходженням хромосом.

У дослідженнях використовували світловий мікроскоп марки „Jenamed 2” (Carl Zeiss Jena). Мікрофотографування здійснювали на плівку „Мікрат–300” за допомогою мікрофотонасадки МФН 11 за збільшення 400Х; і 1100Х, а також за допомогою цифрової фотокамери ”SONY W5“ із цифровим та оптичним збільшенням до 4400 разів.

Статистичну обробку одержаних цифрових даних проводили за допомогою комп’ютерної програми ”Statistica“, вірогідність розбіжностей оцінювали за критерієм Ст’юдента (t_s).

РЕЗУЛЬТАТИ ВЛАСНИХ ДОСЛІДЖЕНЬ

Проведення епізоотичного моніторингу щодо фасціольозу у західному регіоні України. Встановлено, що інвазованість великої рогатої худоби фасціолами у Тернопільській області в 2000 році була високою і становила
18,2 %, в подальшому у 2001–2002 рр. – 16,7–16,4 %, у 2004 р. знизилась до 12,3 %. У Львівській області в 2000–2001 рр. ураження тварин становило 11,6 та 11,7 %, відповідно, було дещо підвищеним (13,5 %) у 2002 р. та суттєво знизилось в 2004 р. до 7,7 %. Епізоотична ситуація щодо фасціольозу в Івано-Франківській області була відносно найсприятливішою. У 2000–2002 рр. інвазованість тварин була від 7,7 до 9,3–9,9 % та знизилась у 2003–2004 рр. до  9,4 і 6,2 % відповідно.

Отже, епізоотична ситуація з фасціольозу великої рогатої худоби у господарствах західних областей України упродовж п’яти років залишалася складною.

Вивчення мітотичної активності та частоти геномної і хромосомної мінливості у популяціях соматичних клітин селезінки та печінкових лімфатичних вузлів клінічно здорових та спонтанно заражених фасціолами тварин. При порівнянні показників мітотичної активності між клітинами
селезінки та лімфовузлів, встановлено, що кількість клітин у стадії ділення була майже однаковою (табл. 1). Досліджено, що у заражених фасціолами тварин, порівняно із здоровими, загальна мітотична активність була дещо підвищеною. У печінкових лімфовузлах клінічно здорових тварин індекс мітотичної активності становив 20 %, у селезінці – 19,94 %; лімфовузлах інвазованих тварин – 20,04 %, селезінці – 19,8 %. У лімфовузлах були вищі показники коефіцієнтів фаз: 2,9 – у здорових та 3,4 – інвазованих тварин. У селезінці вони становили 1,8 та 1,5, відповідно.