КОМБИНИРОВАННАЯ ТРАНСПЛАНТАЦИЯ КРИОКОНСЕРВИРОВАННЫХ ОРГАНОТИПИЧЕСКИХ КУЛЬТУР ЭНДОКРИННЫХ ЖЕЛЕЗ (экспериментальное исследование)

summary

Матеріали і методи дослідження. Робота була виконана на нативних і кріоконсервованих органотипових культурах ендокринних залоз (ОКЕЗ) (щитовидна, підшлункова, надниркова залози, сім’яник, гіпофіз), що отримували від новонароджених поросят. Реципієнтами для трансплантації були щури масою 150–200 г та кролі масою 3-3,5 кг. Експерименти на лабораторних тваринах проводились з дотриманням загальних Національних норм з біоетики (І Національний конгрес з біоетики, Київ, 2001) і положень Європейської конвенції захисту хребетних тварин, які використовуються з експериментальною або іншими науковими цілями (Страсбург, 1985), та були підтримані Комітетом з біоетики ІПКіК НАН України.

Органотипове культивування здійснювали за методом (І.С. Турчин, 1993).

ОКЕЗ піддавали кріоконсервуванню з використанням диметилсульфоксиду (ДМСО) як кріопротектора. Заморожування здійснювали в кріостійких ампулах–контейнерах  фірми „Nunc” на програмному заморожувачі „Cryoson 115” (Німеччина) або над дзеркалом азоту з наступним занурюванням у рідкий азот. Частина кріоконсервованих зразків була використана для рекультивування. Для цього розморожені зразки ОКЕЗ рекультивували протягом 2 діб у живильному середовищі 199 з додаванням 10% інактивованої ембріональної телячої сироватки та антибіотиків. Заміну середовища культивування здійснювали кожну добу.

Сумісне культивування ОКЕЗ у різних комбінаціях проводили в умовах, підібраних для основної культури, при цьому супутня культура була відокремлена від основної напівпроникненою перегородкою.

Життєздатність клітин контролювали методом суправітального забарвлення трипановим синім. Для вимірювання життєздатності ОКЕЗ суспензію клітин отримували ферментативним методом за допомогою 0,25% розчину трипсину.

Базальну секрецію гормонів ОКЕЗ вимірювали в живильному середовищі кожну добу культивування. Стимульовану секрецію гормонів вивчали при додаванні до ОКЕЗ дибутирил – цАМФ (1 мM), хоріонічний гонадотропін (1,5 ОД/мл) і екстракт гіпофіза.

Острівці підшлункової залози (ОПЗ) новонароджених поросят для інтрапортальної трансплантації отримували за методом (G.S. Korbutt, 1996), суспензію клітин Сертолі новонароджених поросят – за методом (R.V. Rajotte, 1997).

Для всіх хірургічних операцій і трансплантацій використовували комбінований наркоз (внутрішньочеревно): кетамін і ксилазин у концентрації 2,5 і 0,5 мг на 100 г маси тварини. Операції двосторонньої адреналектомії проводили за методом (M. Hoffmann, 2000), тиреоїдектомії - за методом (Є.І. Легач, 2005), двосторонньої орхіектомії - за методом (Я.М. Кабак, 1945). Цукровий діабет викликали у щурів массою 180-200 г шляхом одноразової внутрішньочеревної ін’єкції стрептозотоцину (СТЗ) в дозі 55 мг/кг маси тварини, у кролів − одноразової внутрішньовенної ін’єкції алоксану в дозі 100 мг/кг маси тварини.

Рівень глюкози в крові контролювали за допомогою індикаторних пластинок «Гемоглан» на глюкометрі Глюкофот–II.

В залежності від ендокринної недостатності виконували трансплантацію ОКЕЗ під капсулу лівої нирки тварини (органотипові культури щитовидної залози, наднирників та сім’яників), у підшкірну жирову клітковину (органотипова культура підшлункової залози) та інтрапортально (острівці підшлункової залози). Трансплантації органотипової культури щитовидної залози (ОКЩЗ), органотипової культури надниркових залоз (ОКНЗ) і органотипової культури сім’яників (ОКС) проводили безпосередньо після тиреоїдектомії, адреналектомії або орхіектомії. Доза трансплантованого матеріалу в цих випадках складала 35–40 мг. Щурам з ЦД виконували трансплантацію органотипової культури підшлункової залози (ОКПЗ) через тиждень після ін’єкції СТЗ в дозі, яка відповідала ендокринному матеріалу, отриманому з двох залоз новонароджених поросят для одного щура. При комбінованій трансплантації додатково використали ендокринний матеріал, отриманий з одного сім’яника або одного наднирника. Кролям з ЦД трансплантували ОПЗ на 21–23 добу після ін’єкції алоксану в дозі ~ 8,7х10⁶ острівців.

Рівень Т4, ТТГ, тестостерону, кортизолу в середовищі культивування, а також в плазмі крові тварин проводили радіоімунним методом з використанням тест–наборів TOTAL T₄ RIA KIT (Immunotech), РІА–Т4–СТ (Білорусь), TSH RIA KIT (Immunotech), РІА–Тестостерон–СТ (Білорусь), СТЕРОН–К–¹²⁵І–М (Білорусь). Вміст інсуліну вимірювали імуноферментним методом за допомогою набору INSULIN ELISA KIT (DRG Diagnostic) на АІФ–Ц–01С. Кількість гормонів у середовищі культивування нормували на білок, який вимірювали за методом (M. Bradford, 1985).

Вміст альбуміну, холестерину і альфа–амілази досліджували спектрофотометричним методом за допомогою тест–наборів «Філісіт-діагностика» (Україна) та Chol 150 (Lachema), вміст фракції глікозильованого гемоглобіну HbA_1c – за допомогою стандартних наборів GHB 100 та HB 400 S (Lachema).

Гістологічному аналізу піддавали цілу ендокринну залозу новонародженого поросяти як первинний досліджуваний матеріал, ОКЕЗ – після різної попередньої обробки, моно– і комбіновані трансплантати, отримані на 30 і 120 добу, – після трансплантації. Матеріал для гістологічного дослідження фіксували в 10%–му розчині нейтрального формаліну, за стандартною методикою заливали в парафін. Виготовлені на мікротомі зрізи (5–7 мкм) забарвлювали гематоксиліном і еозином та досліджували під світловим мікроскопом.

Для візуалізації острівців після інтрапортального введення в організм реципієнта використовували флуоресцентний поліметиновий барвник DiOC18. Досліджували забарвлені зразки та здійснювали мікрофотозйомку за допомогою люмінесцентного мікроскопа Olympus IX–71.

Статистичну обробку даних проводили за допомогою MS EXCELL 7.0 з використанням функції описової статистики; значення оцінки варіації виражали за допомогою довірчого інтервалу, використовували: t-критерій Стьюдента для кількісних нормально розподілених ознак, однофакторний дисперсійний аналіз. Дані представлені як середні значення, отримані у 2–х аналогічних експериментах і виміряних у 2–х паралельних пробах, ± стандартна похибка; вірогідними вважались відмінності при Р<0,05 і Р<0,01.