Латушкіна Клональне мікророзмноження і оздоровлення лаванди in vitro

summary

У розділі викладено біологічні основи клонального мікророзмноження рослин, приведено народногосподарське значення, ботанічну характеристику і біологічні особливості лаванди, висвітлено сучасні відомості про біотехнологічні дослідження роду Lavandula L., описано основні інфекційні хвороби лаванди і прийоми одержання оздоровленого посадкового матеріалу рослин.

МАТЕРІАЛ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ

Матеріалом для проведення досліджень служили рослини лаванди вузьколистної Lavandula angustifolia Mill. сортів Степова і Синєва та перспективних селекційних зразків 337-9 і 310-17.

Донорні рослини вирощували в умовах закритого грунту. Як експланти використовували апікальні меристеми висотою 0,2-1,0 мм, які виділяли з верхівкових та пазушних бруньок стебла однорічних рослин. При проведенні експериментальної роботи застосовували загальноприйняті методи в культурі ізольованих тканин рослин (Бутенко, 1964; Kartha, 1975; Калінін та ін., 1980). Для культивування ізольованих меристем та мікроживців використовували як базове живильне середовище Мурасиге і Скуга (МС) (Murashige, Skoog, 1962). На кожному з етапів клонального мікророзмноження модифікували гормональний склад живильних середовищ відповідно до необхідного шляху морфогенезу, доповнюючи їх кінетином, бензиламінопурином (БАП), гібереловою кислотою (ГК), нафтилоцтовою кислотою (НОК), індолілоцтовою кислотою (ІОК), індолілмасляною кислотою (ІМК), препаратами емістим С і етамон. Експланти культивували в термостатованій культуральній кімнаті при температурі 25-26 ºС, освітленості 2-3 клк, відносній вологості повітря 60-70 %.

Біологічне тестування донорних рослин лаванди з метою виявлення латентної вірусної інфекції проводили за допомогою рослин-індикаторів: Chenopodium amaranticolor Coste et Reyn., Gomphrena globosa L., Petunia hybrida Hort., Cucumis sativus L. Тестування вихідних рослин і рослин після терапії проводили методом імуноферментного аналізу в непрямій (indirect ELISA) та сендвіч (DAS-ELISA) модифікаціях на 96-лункових полістиролових планшетах, використовуючи кролячі поліклональні антитіла до досліджуваних вірусів та антивидові антитіла, мічені лужною фосфатазою. Результати реєстрували на автоматичному ELISA-рідері “Dynex Technologies” при довжині хвилі 405 нм.

При розробці прийомів одержання оздоровленого посадкового матеріалу застосовували методи культури апікальних меристем, термотерапії in vitro і хемотерапії. Термотерапії в умовах in vitro піддавали мікропагони (неукорінені мікророслини) та мікророслини другого пасажу. Режим термотерапії: температура 37±1 ºÑ, освітленість 2-3 клк/м², фотоперіод 16 год., відносна вологість повітря 60-70 %. У дослідах з хемотерапії використовували віразол (рібавірін,                                  1-β-D-рибофуранозіл-1,2,4-триазол-3-карбоксамід, “Sigma”, Німеччина), який додавали до живильного середовища в концентрації від 5,0 мг/л до 30,0 мг/л.

Для розмноження вихідних меристемних рослин застосовували метод зеленого живцювання. Живці обробляли регуляторами росту: водними розчинами ІМК (25,0 мг/л) та ІОК (100,0 мг/л) і ростовими пудрами Chryzotop, Chryzotek і Rhizopon A.

Математичну обробку результатів досліджень проводили з використанням методів математичної статистики (Лакин, 1980; Доспехов, 1985) на персональному комп’ютері за допомогою програми Excel 7.0 з пакету прикладних програм Microsoft Office^â для Microsoft Windows^â.

ОСНОВНІ ЕТАПИ КЛОНАЛЬНОГО МІКРОРОЗМНОЖЕННЯ ЛАВАНДИ НА ОСНОВІ КУЛЬТУРИ ІЗОЛЬОВАНИХ МЕРИСТЕМ IN VITRO

У процесі досліджень вивчали особливості морфогенезу ізольованих апікальних меристем лаванди в культурі in vitro, визначали вплив ендо- та екзогенних факторів і підбирали оптимальні умови для розвитку експлантів на чотирьох етапах клонального мікророзмноження: ізолювання експланту, введення і ініціація його розвитку в умовах in vitro; власне мікророзмноження; укорінення мікропагонів; адаптація мікророслин до умов in vivo.

Ізолювання експланту, введення і ініціація його розвитку в умовах in vitro

Стерилізація рослинного матеріалу. Методику стерилізації рослинного матеріалу було обрано з врахуванням літературних даних (Єгорова, 2002). Стерилізацію експлантів проводили послідовним витримуванням фрагментів пагонів у 70 %-ному етанолі 40 секунд, 50 %-ному розчині препарату “Брадофен” 12 хвилин, і тричі промивали в автоклавованій дистильованій воді. Дослідження показали, що такий спосіб стерилізації забезпечував вихід стерильних меристем на рівні 100,0 %, приживлюваність меристем складала 96-100 %.

Підбір складу і консистенції живильного середовища для росту ізольованих меристем лаванди. На етапі введення меристем лаванди в культуру in vitro підбір оптимальної концентрації гормонів проводили на основі живильного середовища МС, що містило 0,7 % агару. В результаті досліджень встановлено, що ізольовані меристеми лаванди характеризуються високою регенераційною здатністю – частота регенерації пагонів складала 85-100 % на всіх варіантах живильного середовища. Оптимальним визначено живильне середовище, доповнене кінетином (1,0 мг/л) і ГК (1,0 мг/л) - МС5, на якому частота регенерації складала 100 %, розвивався основний пагін висотою 19,33-42,98 мм з 5-8 парами листків і 3,03-   7,81 шт. додаткових пагонів.

З метою визначення оптимальної консистенції живильного середовища для культивування апікальних меристем лаванди були випробувані тверді середовища з вмістом агару 0,7 %, та рідкі без додавання агару, які доповнювали кінетином або кінетином і ГК. У всіх варіантах досліду виявлено перевагу твердих середовищ. Зниження частоти регенерації на рідких середовищах, у порівнянні з твердими, було незначним у сортів лаванди – у сорту Синєва на 2,5–5,0 %, у сорту Степова на 10 %, тоді як у селекційних зразків різниця за цим показником склала 22,5-35,0 % у зразку 337-9 і 30,0–57,5 % у зразку 310-17. При культивуванні меристем на рідких середовищах спостерігалося достовірне зменшення висоти основного пагона, частоти множинного пагоноутворення, кількості додаткових пагонів, спостерігалося формування мікропагонів з морфологічними змінами і висока частота вітрифікації пагонів – 62,9–71,0 % у всіх досліджуваних генотипів.

Морфогенез і регенерація рослин лаванди в культурі in vitro. Дослідження показали, що направленість регенераційних процесів у досліджуваних сортів та зразків була подібною, однак, виявлено достатньо чіткий поділ їх за інтенсивністю розвитку меристем в умовах in vitro. Найбільш раннім розвитком характеризувалися меристеми сорту Степова. Приживлюваність і збільшення меристем у розмірах були помітними вже на 3–4 добу культивування, на 6–8 добу відбувалося формування і розкриття першої пари листків, а через 1–3 доби спостерігали початок розвитку основного пагону. Проліферацію множинних пагонів відмічали на 12–14 добу культивування. У сорту Синєва окремі етапи морфогенезу наставали в середньому на 2–6 діб пізніше. Меристеми зразка 337-9 розвивалися майже одночасно з сортом Степова, але закладання додаткових пагонів затримувалося на 4–8 діб. Найбільш повільно розвивалися меристеми зразка 310-17, у яких окремі етапи морфогенезу наставали на 2-8 діб пізніше, ніж у сорту Степова. Слід зазначити, що у лаванди на першому етапі клонального мікророзмноження множинне пагоноутворення відбувалося, в основному, за рахунок формування адвентивних пагонів, тоді як кількість бічних пагонів, що розвивалися з пазушних бруньок, складала лише 9,1-17,7 % від загальної кількості додаткових пагонів на один експлант.