Ліманська Н.В. Бактеріальний рак винограду (діагностика та поширення на півдні України)

summary

Складається з 9-ти підрозділів, в яких розглянуто систематичне положення та біологічні властивості бактерій видів Agrobacterium tumefaciens і Agrobacterium vitis. Докладно висвітлено будову генетичного апарату пухлинотвірних штамів Agrobacterium, патогенез та поширеність захворювання, сприйнятливість рослин до ураження бактеріальним раком, методи виявлення патогенних агробактерій та заходи захисту рослин.

УМОВИ, МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Матеріалом дослідження слугували культури агробактерій, виділені з 705 зразків рослинного матеріалу з виноградників півдня України і садивного матеріалу, імпортованого з країн ЄЕС, та з 431 зразка ґрунту виноградників, а також колекційні штами A. tumefaciens С58,  A. vitis АТ1, A. vitis АВ3,                    А. tumefaciens FA2 і A. radiobacter К55. Методом візуального фітосанітарного обстеження досліджували насадження винограду прищепних та підщепних сортів у  АСТ “Украгро” Одеської області). Проводили обстеження фітосанітарного стану кожного куща (Леманова, 1988).

          Агробактерії із здерев'янілої лози та коренів виділяли згідно методу  Я. Лехоцки (Lehoczky, 1971). Для виділення використовували середовище Рой і Сасера (Roy, Sasser,  1983;  Manulis  et  al.,  2002).  Пасоку   використовували   для   прямого   аналізу методом ПЛР, а також підрощували на середовищі Рой і Сасера для збільшення кількості бактеріальної біомаси (Szegedi, Bottka, 2002). Агробактерії виділяли з пухлин (Методические указания, 1981).

          Ґрунт для дослідження на присутність збудника бактеріального раку відбирали у ризосфері кущів винограду, в міжряддях виноградника і на ділянках, призначених для закладання виноградників. Із ґрунту агробактерії виділяли за модифікованою методикою (Krimi et al., 2002; Лиманская, 2003).

          Для тестування в ПЛР використовували одно-дводобові культури агробактерій, які виросли на картопляному агарі (Haas et al., 1995). Для виділення ДНК агробактерій використовували набір “ДНК-сорб“ фірми “АмплиСенс” (Росія). ДНК також виділяли методом теплового лізису бактеріальних суспензій згідно з J. Haas et al.  (1995) і  E. Szegedi and S. Bottka (2002).

         Реакційну суміш для проведення ПЛР для виявлення збудника бактеріального раку готували згідно з J. Haas et al.  (1995), проте концентрації низки компонентів і параметри ампліфікації були змінені (Мілкус та інші, 2005).

         У якості тест-рослин використовували томати (Lycopersicon esculentum Mill.), зелені чубуки винограду (Vitis vinifera L.) та диски коренеплодів моркви (Daucus carrota L.). Зараження тест-рослин проводили за загальноприйнятими методиками (Леманова, 1988; Goodman et al., 1993).

           Отримані результати обробляли засобами математичної статистики на основі пакета прикладних програм “Statistica 6.0”. Оцінку відмінності між вибірками проводили за допомогою критерію Пірсона (ч²) (Доспехов, 1985).                                                                             

ФІТОСАНІТАРНЕ ВІЗУАЛЬНЕ ОБСТЕЖЕННЯ ВИНОГРАДНИКІВ

             Ураженість сорту Каберне Совіньон на окремих ділянках АСТ “Украгро” Одеської області становила від 0,3 до 11 %. Різний відсоток хворих кущів на окремих ділянках виноградника, імовірно, пов'язаний з походженням садивного матеріалу.     Так,     на         виноградниках,     закладених     садивним    матеріалом,     імпортованим  у 1999-му році, бактеріальний рак був виявлений у 0,3 % кущів, а на виноградниках, посадковий матеріал для закладки яких був імпортований у 2000-му році, кількість уражених кущів становила від 7,0 до 11 %.

          Серед рослин сорту Мерло рожевий у 2002 році відмічено 0,1 % хворих на бактеріальний рак кущів, а в 2003 році кількість рослин з симптомами бактеріального раку становила 13 %, тобто збільшилася за один рік у 130 разів. Збільшення кількості хворих рослин у вказані роки спостерігалось також на насадженнях сорту Піно чорний (0,23 % у порівнянні з 0,003 %) і Шардоне (0,15 % у порівнянні з 0,05 %).

           На виноградниках сорту Мускат олександрійський виявлено 16,0 % кущів, хворих на бактеріальний рак.

             Обстежені ділянки виноградників були закладені посадковим матеріалом, імпортованим із Франції. До системи сертифікації посадкового матеріалу винограду, прийнятої Європейським економічним співтовариством, не входить тестування рослин на   наявність  збудника  бактеріального  раку  винограду, внаслідок чого імпортований садивний матеріал може бути латентно інфікованим. На підщепних сортах V. berlandieri  x  V. riparia Кобера 5ББ,  V. berlandieri  x         V. riparia CO₄,  V. riparia x V. rupestris 101-14 та V. riparia x V. rupestris 3309 методом візуального обстеження рослини із симптомами захворювання на бактеріальний рак виявлені не були.

ОПТИМІЗАЦІЯ МЕТОДИКИ ПЛР ДЛЯ ВИЯВЛЕННЯ ПУХЛИНОТВІРНИХ АГРОБАКТЕРІЙ

           У ході дослідження тест-система для виявлення збудника бактеріального раку винограду на основі ПЛР була нами оптимізована. Об'єм реакційної суміші для проведення ПЛР, запропонованої J. Haas et al. (1995), був зменшений з 50 мкл до 20 мкл. Використовували п'ятикратний буфер для проведення ПЛР з крезоловим червоним  фірми “АмплиСенс” (Росія). Реакційна суміш містила       0,5 мкМ кожного з праймерів. Після оптимізації складу реакційної суміші концентрація Mg⁺⁺ становила 2 ммоль. Кількість одиниць Taq-полімерази у реакційній суміші була збільшена до  2 Од. Оптимізована реакційна суміш була застосована для ампліфікації ДНК агробактерій з праймерами ipt  і з праймерами virD₂. Бактеріальну ДНК для проведення ПЛР виділяли декількома способами, і для тестування зразків був обраний метод Szegedi and Bottka (2002). Температура відпалу була підвищена до 52 єС у порівнянні з 50 єС, запропонованими J. Haas et al. (1995). Оптимізована методика ПЛР застосовувалась нами у подальшому для тестування ДНК штамів агробактерій, виділених з тканин винограду і ґрунту (рис.1).

Рис. 1. Електрофорез продуктів ампліфікації ДНК штамів агробактерій з праймерами ipt в агарозному гелі. 1, 5 - ipt-позитивні штами Agrobacterium sp., виділені із винограду; 2, 3 – зразки не містили ipt-позитивних штамів агробактерій; 4 – патогенний штам A. tumefaciens FA2; 6 – негативний контроль (дейонізована вода); М – маркери молекулярної ваги.

         В літературі малочисельні дані щодо співвідношення virD₂- і ipt-позитивних штамів серед агробактерій, виділених на виноградниках (Haas et al., 1995; Lastra et al., 2000; Manulis et al., 2002). Наші дослідження показали, що не всі virD₂-позитивні штами агробактерій, виділені із здерев'янілих пагонів винограду та ґрунту виноградників на  півдні України, виявились ipt-позитивними (рис. 2).

 Рис. 2. Тестування ДНК штамів virD₂-позитивних агробактерій методом ПЛР з використанням праймерів до послідовності  ipt.

          Для перевірки рослин на зараженість збудником бактеріального раку при виробництві посадкового матеріалу слід тестувати ДНК виділених штамів агробактерій як з праймерами до послідовності ipt, так і з праймерами до послідовності virD₂,  що узгоджується з даними попередніх дослідників (Haas et al., 1995; Manulis et al., 2002).