порушення обміну ліпідів та прооксидантно-антиоксидантних процесів за експериментального моделювання метаболічного синдрому

summary

Огляд літератури. В огляді літератури проаналізовано сучасні уявлення щодо біохімічних порушень, що супроводжують метаболічний синдром, зокрема  атерогенез, стресові стани,  фактори ризику та  існуючі підходи до корекції даної патології. Особлива увага приділяється сучасним відомостям щодо порушень обміну ліпідів при метаболічному синдромі та стресі, а також аналізу переваг та недоліків наявних методів фармакокорекції проатерогенних змін.

Матеріали та методи дослідження. У роботі було використано 586 сирійських хом’ячків обох статей віком 4 тижні, 20 тижнів та 1 рік, 423 білих щура обох статей 3-х місяч­ного віку, та 42 білі миші віком 1 міс., що утримувались у стандартних умовах віва­рію ЦНДЛ НФаУ.

З метою дослідження загальних та специфічних механізмів розвитку проатерогенних змін були обрані такі експериментальні моделі: на хом’ячках моделювали метаболічний синдром та хронічний стрес – стани, протилежні за характером метаболічних зміни в організмі, перший пов’язаний з надлишковим надходженням джерел енергії, а другий – з активацією їх використання. Разом з тим, оскільки стрес-реакція є універсальною реакцією відповіді на дію різноманітних факторів, для з’ясування ролі нетривалого стресування в проатерогенезі,  досліджували зміни метаболізму також на моделях гострого стресу різної етіології: нейрогенному (оскільки це дозволило б порівняти зміни при хронічному та гострому нейрогенному стресі) та оксидативному (що дало б змогу відокремити нейрогенні зміни від метаболічних). В роботі також досліджували можливість корекції окисних пошкоджень, що спостерігаються при стресі та метаболічному синдромі за допомогою поліфенольних комплексів Винограду культурного.

Метаболічний синдром моделювали на сирійських хом’ячках різної статі та віку, які отримували дієту, збагачену на джерела метаболічної енергії  (переважно насичені ліпіди та фруктозу). На хом’ячках також моделювали хронічний соціальний стрес скупчення та гострий хімічний стрес, спричинений введенням сублетальних доз солей важких металів – хлоридів кобальту та кадмію (3 та 0,2 мг на 100 г маси тіла відповідно). Тварин декапітували через 2 год після одноразової внутрішньо­черевинної ін’єкції солі. Оксидативний стрес також моделювали на щурах та мишах шляхом одноразового введення сублетальної дози хлориду меркурію (0,7 мг на 100 г маси тіла).

Емоційно-больовий стрес моделювали на безпородних щурах-самицях масою 180-220 г. Всі експериментальні тварини були розділені за стійкістю до стресу на стійких і нестійких (метод відкритого поля). Стрес викликали іммобілізацією на череві протягом 3 год [Соколова Е.Д., 1996]. Тварин декапітували через 3 години після іммобілізації. Самиці були відібрані тому, що, як відомо [Wang J., 2007], вони гостріше за самців реагують на емоційний стрес. На щурах (самцях масою 180-220 г) також моделювали гострий хімічний стрес, викликаний введенням сублетальних доз солей важких металів [Губський Ю.І., 2002]. Тварин декапітували через 2 год після одноразової внутрішньочеревинної ін’єкції солі.

Всіх тварин декапітували під хлоралозо-уретановим наркозом [Сидоряк Н.Г., 1985]. Дослідження проводилися відповідно до національних “Загальних етичних принципів експериментів на тваринах” (2001), що узгоджуються з положеннями “Європейської конвенції про захист хребетних тварин, які використовуються для експериментальних та інших наукових цілей” (Страсбург, 1985). У декапітованих тварин збирали кров для отримання сироватки, печінку перфузували та видаляли для отримання 25% гомогенату та цитозолю (шляхом диференціального центрифугування), серце та нирки використовували для визначення вмісту поліфенолів, черепну коробку обережно відкривали та виділяли гіпоталамус.

Рівень глюкози натще в крові тварин визначали глюкозооксидазним методом із застосуванням ферментативного аналізатора глюкози «Ексан-Г» (Литва). Рівень імунореактивного інсуліну (ІРІ) в сироватці крові визначали методом радіоімунологічного аналізу in vitro. Індекс інсулінорезистентності (ІР), що ґрунтується на одночасному визначенні індивідуальних рівній ІРІ та глюкози в сироватці крові натще, розраховували за допомогою алгоритму НОМА (Homeоstasis Model Assessment) [Matthews D. R., 1985]. Вміст лептину та адипонектину в плазмі крові визначали імунохімічно за допомогою стандартних наборів Quintikine M Kit (R&D Systems Inc.). Вміст анандаміду в гіпоталамусі визначали методом рідиннофазної хромато-масспектрометрії при атмосферному тиску та температурі 400°С на колонках Phenomenex (5 мм, 150´4,5 мм) зі зворотною фазою; m/z=348 [Maccarone M., 2004]. Вміст кортикостерону, кортизолу, тестостерону (Т) та естрадіолу (Е2) визначали імуноферментно за допомогою стандартних наборів реактивів.

Ліпопротеїни (ЛП) фракціо­нували методом диск-электрофорезу у вертикальних пластинах ПААГ [Колб В.Г., 527] роз­мі­ром 160´140´2 мм. Электродним буфером служив 0.01 М трис-гліци­новий буфер, рН 8,3. Электрофорез проводили за постійного струму 60 мА на гель протягом 1,5 год. Концентрацію b- та пре-b-ліпопротеїнів (апо-В-ЛП) сироватки крові та цитозолю печінки в сумі визначали турбідиметричним методом [Колб В.Г., 1982]. Використовуючи визначену таким чином концентрацію апо-В-ЛП, та дані про відсоткове співвідношення між фракціями ліпопротеїнів, що були отримані за допомогою електрофорезу, розраховували вміст кожної з ліпопротеїдних фракцій.

З ЛП цитозолю печінки та сироватки крові після фракціонування електрофорезом в ПААГ екстрагували ліпіди за методом Bligh and Dyer [Финдлей Дж.Б., 1990] з деякими модифікаціями. Вміст фосфоліпідів (ФЛ) визначали за фосфатом, що входить до їх складу, методом Фіске і Суббароу з модифікаціями Бартлета [Финдлей Дж.Б., 1990]. Вміст моно-, ди- та триацилгліцеролів (ТАГ) визначали за допомогою стандартного ферментативного набору фірми “KONE” (Фінляндія). Вміст вільного та естерифікованого холестеролу (ВХс та ЕХс) визначали за допомогою стандартних ферментативних холестеролоксида­з­них наборів фірми “Boehringer Mannheim GmbH diagnostica” (Ні­меч­чи­на). Вміст загальних ліпідів (ЗЛ) визначали за допомогою стандартного набору Eagle Diagnostics (США) — реакція з ваніліновим реактивом.

Визначення вмісту проміжних продуктів ПОЛ [Волчегорский И.Ф., 1989] проводили в гептан-ізопропанольних екстрактах спектрофотометрично за довжини хвилі 220 нм (для сполук з ізольованими подвійними зв’язками – ІПЗ), 232 нм (для дієнових кон’югатів – ДК) та 278 нм (для кетодієнів та сполучених триєнів – КД+СТ). Визначення кількості загальних гідропероксидів (ЗГП) [Романова Л.А., 1977] проводили спектрофотометрично за реакцією з тіоціанатом амонію. Визначення кількості ТБК-активних продуктів (ТБК-АП) проводили за реакцією з тіобарбітуровою кислотою [Строев Е.А., 1986]. Визначення кількості a-токоферолу (a-Т) [Кибардин С.А., 1951] проводили за допомогою колориметричного визначення за кольоровою реакцією з двохвалентним ферумом (індикатор a,a’-біпіридил); до результатів визначення вносили поправку на присутність холестеролу. Вміст відновленого глутатіону (ВГ) визначали за реакцією з алоксаном [Путилина Ф.Е., 1982]. Активність каталази визначали за інтенсивністю розкладу пероксиду гідрогену [Переслегина И.А., 1999]. Вміст білка визначали за методом Лоурі в модифікації Міллера. Визначення вмісту аскорбінової кислоти (АК) проводили титриметрично за реакцією з 2,4-дихлорфеноліндофенолом у складі реактиву Тільманса [Ермаков А. И., 1972]. Активність параоксонази (PON) визначали спектрофотометрично за поглинанням світла 2,4 динітрофенолом, що утворюється в ферментативній реакції розкладу параоксону [Kujiraoka T., 2000].

Активність ліпопротеїнліпази (ЛПЛ) та печінкової тригліцеридліпази (ПЛ) визначали за методом Lithell and Boberg [Lithell H., 1978]. Активність ферментів визначали за вивільненням [³H]олеїнової кислоти до інкубаційного середовища. Ліпіди розділяли за допомогою тонкошарової хроматографії. Радіоактивність вимірювали у сцинтиляційній рідині ЖС-8. Швидкість естерифікації холестеролу (ЕтХс) та переносу ефірів холестеролу (ПЕХс) оцінювали в виділених за допомогою центрифугування фракціях ліпопротеїнів високої щільності (ЛВЩ) шляхом інкубації даної фракції (для визначення швидкості переносу естерів холестеролу – з додаванням 5,5’-дитіобіс-2-нітробензойної кислоти) та визначення вмісту вільного холестеролу та його ефірів до та після інкубації [Творогова М.Г., 1999]. Активність глюкозо-6-фосфат-дегідрогенази (Г-6-Ф-ДГ), 6-фосфоглюконат-дегідро­генази (6-ФГ-ДГ) та малатдегідрогенази (МДГ) визначали спектрофотометрично за відновленням НАДФ⁺ [Путилина Ф.Е., 1982]. Активність кислої лізосомальної ліпази (ЛЛ) визначали в лізосомально-мітохондріальній фракції печінки за розщепленням субстрату – 4-метилумбеллі­феррилолеату; вміст продукта гідролізу визначали флуориметрично (Е=449 нм, 410 нм) [Aslanidis C. 1996]. Активність глутатіонредуктази (ГР) визначали спектрофотометрично за окисненням НАДФН (Н⁺) [Карпищенко А.И., 1997].

Статистичну обробку отриманих результатів проводили з використанням Х-критерію Ван-дер-Вардена [Закс Л. 1976] на персональному комп'ютері з використанням пакетів Excel та Statistica, коефіцієнт кореляції визначали за