Рябовол Розробка біотехнологічних методів і використання їх для створення вихідного селекційного матеріалу цикорію коренеплідного (Cichorium intybus L.) та буряків цукрових(Beta vulgaris L.)

summary

РОЗДІЛ 1. СУЧАСНИЙ СТАН, ПРОБЛЕМИ ТА ПЕРСПЕКТИВИ РОЗВИТКУ БІОТЕХНОЛОГІЧНИХ МЕТОДІВ У СЕЛЕКЦІЇ РОСЛИН (огляд літератури)

На основі аналізу джерел літератури викладено теоретичні засади та нові селекційні схеми з використанням біотехнологічної ланки при вирішенні наукової проблеми зі створення, добору і зберігання вихідного матеріалу для отримання високопродуктивних сортів цикорію коренеплідного та гетерозисних гібридів буряків цукрових. Вищезазначені питання в Україні вивчено недостатньо, що стало підставою проведення наших досліджень.

РОЗДІЛ 2. УМОВИ, МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Дослідження за даною темою дисертаційної роботи проводили протягом 1994–2009 рр. у лабораторії біотехнології Уманського державного аграрного університету (УДАУ) та лабораторії культури тканин Інституту коренеплідних культур УААН (ІКК). Рослинні матеріали для досліджень вирощували на дослідних ділянках УДАУ та ІКК УААН, а також в окремих боксах теплиці інституту.

Донорним матеріалом у дослідах слугували сорти цикорію коренеплідного Уманський 95, Уманський 97, Уманський 99 та гетерозиготні за геном R стерильні та фертильні форми компонентів гібридів буряків цукрових Кубанський ЧС 36, Арій 1, Уладовський ЧС 36, Альтій.

Першу серію досліджень було спрямовано на вивчення біотехнологічних умов отримання та культивування різних типів тканин цикорію коренеплідного.

При проведенні біотехнологічних досліджень керувались загальними принципами та методиками роботи з культурами рослинних тканин, розробленими Р.Г. Бутенко (1989), В.В. Калініним, В.В. Сарнацькою, В.Е. Поліщук (1980).

Для стерилізації інтактних рослинних матеріалів використовували розчини хлораміну в концентрації 5,0–15,0% та дихлориду ртуті (сулеми) — 0,05–0,15%.

Для мікроклонального розмноження на кожному етапі клонування (активація меристем, регенерація, розмноження, ризогенез) експериментально визначали склад живильного середовища та його фітогормональну оптимізацію. В основу живильного субстрату входили макро- і мікроелементи за прописами середовищ Мурасіге–Скуга та Гамборга (Murashige T., Skoog F., 1962; Gamborg O.L., Eveleigh D.E., 1968). Модифікували живильні середовища цитокінинами (6-бензиламінопурин, кінетин) та ауксинами (індолілоцтова кислота, нафтилоцтова кислота, гетероауксин). Середовища готували та стерилізували за стандартним методом (Р.Г. Бутенко, 1964).

Адаптацію рослинного матеріалу до умов навколишнього середовища проводили двома методами: рослини in vitro в адаптаційних кімнатах; проміжна адаптація при використанні теплиці. У селекційно-тепличному комплексі режим вирощування рослин задавали згідно методичних рекомендацій, розроблених в ІЦБ УААН для буряків цукрових (Зубенко В.Ф., Чудновський Б.Д., 1983).

Укорінення та розвиток акліматизованих рослин в умовах ex vitro стимулювали впливом гетероауксину (0,5–1,5 мг/л) та параамінобензойної кислоти (0,01–0,0001 мг/л).

Розвиток генеративних пагонів цикорію коренеплідного в ізольованій культурі в перший рік життя рослини індукували модифікованими живильними середовищами з додаванням до їх складу α–індолілмасляної кислоти (0,1– 2,0мг/л) та гібереліну (1,0–2,0 мг/л).

Для індукції калюсогенезу цикорію коренеплідного в основу живильного субстрату вводили макро- і мікроелементи за прописом середовищ Мурасіге–Скуга (Murashige T., Skoog F., 1962), Гамборга (Gamborg O.L., Eveleigh D.E., 1968) та Шенка–Хільдебрандта (Schenk R.U., Hildebrandt A.C., 1972).

Модифікуючи склад середовищ, вивчали вплив регуляторів росту (2,4-дихлорфеноксиоцтова кислота в концентрації 0,1–2 мг/л, нафтилоцтова кислота в концентрації 0,1–2,0 мг/л) на калюсотвірну здатність різних типів тканин цикорію. Для обліку приросту калюсу визначали відносний приріст сирої калюсної маси за формулою С. Кепліна (Caplin S.M., 1946).

Морфогенетичну активність калюсної тканини (органогенез, соматичний ембріоїдогенез) індукували введенням до живильного середовища різних співвідношень та концентрацій цитокінину/гіберелової кислоти, а також дією низьких позитивних температур (4⁰С). У період формоутворюючих процесів спостерігали за розвитком структур, їх кількістю та морфологічними і цитологічними характеристиками. Початковий період органогенезу та соматичного ембріоїдогенезу фіксували за допомогою комп’ютерної зйомки.

Для підвищення активності формування соматичних ембріоїдів та рослин-регенерантів до живильного середовища додавали абсцизову кислоту (0,1–5,0 мг/л).

У другій серії досліджень передбачали роботу з ізольованими тканинами буряків цукрових.

Для підвищення виходу гаплоїдів і гомодиплоїдів буряків цукрових поєднали культуру ізольованих насіннєвих зачатків та гіногенетичне стимулювання запиленням рослини-донора експланта пилком рослин виду Beta webbiana L. Культивування насіннєбруньок проводили на модифікованому живильному середовищі MS (Рябовол Л.О., 1994).

Спонтанну диплоїдизацію гаплоїдних матеріалів буряків цукрових у культурі in vitro вивчали при тривалому культивуванні гаплоїдів у ізольованій культурі. Для депонування рослин у досліді використовували методику та середовище розроблене вченими ІЦБ УААН (Редько В.І., Ільєнко І.І., Павловська Л.Л., 1997).

Для індукованої диплоїдизації гаплоїдних рослин використовували колхіцин у концентрації 0,1–0,2% (за експозиції 12–24 год.). У дослідженнях застосовували три методи впливу колхіцину на рослину в культурі in vitro: краплинний метод – обробка апікальної меристеми клонованих рослин в ізольованій культурі; заливка точки росту біоматеріалу поліплоїдизуючою речовиною в пробірці; додавання препарату до ростового живильного середовища.

Для створення активної генетичної колекції цикорію коренеплідного та буряків цукрових вивчали вплив температурного фактору (7⁰С–16⁰С) та вуглеводного живлення (сахароза –10,0 г/л, агар-агар – 10,0 г/л).

Ідентифікацію плоїдності проводили під мікроскопом МБІ–13, підраховуючи кількість хромосом у давлених препаратах, отриманих із калюсу чи соматичних клітин апікальної меристеми клонованих рослин цикорію та буряків, за методикою, розробленою в лабораторії генетики і цитології ІЦБ УААН (Литвиненко И.И., Ворохов В.Г., Кирсанова Ю.В., 1988).

Статистичну обробку результатів досліджень виконували методами дисперсійного, кореляційного та регресійного аналізу з використанням прикладної програми «Statistica – 6» (Мойсейченко В.Ф., Єщенко В.О., 1994; Царенко О.М., Злобін Ю.А., Скляр В.Г., 2000).

РОЗДІЛ 3. ТЕХНОЛОГІЯ МІКРОКЛОНАЛЬНОГО РОЗМНОЖЕННЯ РОСЛИН CICHORIUM INTYBUS L.

Для збереження та прискореного розмноження цінних рослинних генотипів доцільно застосовувати мікроклональне розмноження. Даний метод базується на регенераційній здатності тотипотентних рослинних клітин, що дає можливість нескінченно довго розмножувати та зберігати відносно незмінними генотипи. Це питання особливо важливе при веденні селекції перехреснозапильних культур, до яких належить цикорій коренеплідний.

При розробці методу мікроклонального розмноження рослин цикорію вивчали п’ять послідовних етапів клонування, першим з яких є добір та введення експлантів в культуру in vitro. Отримані нами результати підтверджують те, що найкращим експлантом для мікроклонування цикорію коренеплідного є апікальна меристема рослин, так як вона генетично стала, здебільшого звільнена від вірусної інфекції та вирізняється високою морфогенетичною здатністю.

Найефективнішою стерилізуючою речовиною для введення меристеми в ізольовану культуру визначено 0,1%-вий розчин сулеми за експозиції 20 хвилин. Вихід стерильних біоматеріалів у цьому варіанті досліду склав 96,0%. Порівнюючи два способи вирощування донорного матеріалу та вплив на інфікування початкових експлантів, ми дійшли висновку, що вирощування рослин цикорію коренеплідного в умовах закритого ґрунту сприяє отриманню в культурі in vitro 96,0% неінфікованих експлантів. Це на 15,0% більше, аніж з польового матеріалу. Отримані результати можна пояснити умовами вирощування експериментальних генотипів у теплиці, які дозволяють оптимізувати розвиток рослини-донора експлантів за рахунок штучного створення оптимальних умов вегетації, включаючи полив та підвищення інтенсивності освітлення, і уникнути забруднення листкового апарату ґрунтовою сумішшю.

Розвиток апікальних меристем, експресія або пригнічення тотипотентності значною мірою залежить від умов in vitro, у які потрапляє біоматеріал. Серед них найважливішими фізичними факторами є освітлення, температурний режим, вологість. У наших дослідженнях після стерилізації апікальну меристему висаджували на живильне середовище і культивували при температурі 20–24⁰С, 16-ти годинному фотоперіоді з інтенсивністю освітлення 3–5 кілолюкс і відносній вологості 75%. При створенні фізичних умов вирощування для клонування рослин цикорію коренеплідного було сконцентровано увагу на спектрі освітлення культуральної кімнати, так як на думку Т. Мурасіге (Murashige T., 1974) використання відповідного спектру світла, який залежить від виду біоматеріалу, суттєво впливає на інтенсивність розвитку рослин in vitro.

У наших дослідах світло червоного спектру, з енергією світлових квантів на рівні 1,95 еВ, у ізольованій культурі інтенсифікувало процеси розвитку апікальних меристем та коренів рослин цикорію коренеплідного, але стримувало калюсогенез і морфогенез калюсних тканин. Натомість світло блакитного спектру, енергія світлових квантів якого була 2,53 еВ, стимулювало процеси морфогенезу калюсних тканин і позитивно впливало на індукцію калюсогенезу, розвитку апікальних меристем та коренів цикорію. Таким чином, встановлено, що для розвитку апікальних меристем, формування адвентивних бруньок, укорінення рослин цикорію коренеплідного ефективно використовувати червоний спектральний склад світла з довжиною хвилі 624–650 нм, для калюсогенезу та морфогенезу — блакитний з довжиною хвилі 480–504 нм.

Вивчення фізичних умов вирощування рослин у культурі in vitro є важливим етапом роботи, проте основним і найскладнішим залишається підбір компонентів живильного середовища, концентрації та співвідношення регуляторів росту у їх складі, які і визначають напрями розвитку біоматеріалу.

У наших дослідженнях для введення та культивування меристем цикорію коренеплідного аналізували 50 модифікованих середовищ. Для активації розвитку меристем в основу живильного субстрату вводили макро- і мікроелементи за прописами середовищ Мурасіге–Скуга та Гамборга, вітаміни — за Уайтом. Для вивчення впливу концентрації та співвідношення екзогенних регуляторів на розвиток меристем біовиду живильні субстрати модифікували регуляторами росту групи ауксинів і цитокінинів. У результаті проведених досліджень встановлено, що модифіковане середовище Мурасіге–Скуга з додаванням 6-бензиламінопурину у концентрації 1,0 мг/л, β-аланіну — 1,0 мг/л; L-глютаміну — 1,0 мг/л, гіберелової кислоти — 0,05 мг/л (MS–3) ініціювало до мікроклонального розмноження 96,0% експлантів, сприяло швидкому закладанню адвентивних бруньок та розвитку їх меристем (патент № 24325, 2007).