Теслюк Удосконалення методів культури in vitro для селекції та розмноження винограду

summary

Методи культури органів та тканин  in  vitro в селекції та розмноженні винограду (Огляд літератури)

В огляді літератури показано стан розвитку експериментальної гаплоїдії на основі культивування ізольованих пиляків та можливості підвищення ефективності цього методу для культури винограду. Проведено аналіз вітчизняних та зарубіжних публікацій, присвячених розробці сучасних методів культури in vitro для одержання вихідного селекційного матеріалу та покращення генофонду винограду безнасіннєвих, ранньостиглих та великоплідних сортів, а також прискорення окремих етапів селекційного процесу. Особливу увагу приділено актуальним проблемам прискореного клонального мікророзмноження винограду, розробці способів підвищення ефективності розмноження винограду in vitro та напрямкам оптимізації первинних процесів мікроклонування.

На основі аналізу літературних джерел було зроблено висновок про актуальність особистих досліджень, обґрунтовано вибір теми та основні напрямки даної дисертаційної роботи.

Матеріали і методи досліджень

Дослідження виконані протягом 1997–2009 рр. у відділі розсадництва та розмноження винограду та в теплицях лабораторно-тепличного комплексу ННЦ “ІВіВ ім. В.Є. Таїрова”.

Дослідження проводили на столових і технічних сортах та клонах винограду: Кишмиш лучистий, Мєчта, Аркадія, Оригінал, Кобзар, Каберне Совіньйон клон 441, Марсельский чорний ранній клон 1294, Шардоне клон 4876, Трамінер рожевий клон 832. Вихідний матеріал відбирали з кущів – донорів, які ростуть на клоно-дослідній та селекційній ділянках інституту, а також в теплицях Центру клонової селекції і які були тестовані на відсутність вірусної та бактеріальної інфекції.

Для культури пиляків винограду вихідним матеріалом були суцвіття, із яких виділяли пиляки і вводили в культуру in vitro. Використовували методичні рекомендації З.П. Паушевої (1988), Н.І. Прозіної (1960), Камеліної О.П. та ін. (1992). В дослідженнях ми випробовували 4 варіанти поживних середовищ: Мурасіге і Скуга (МС), Уайта, Гамборга та Ніча і Ніч (НіН) з однаковим набором вітамінів, сахарози та фітогормонів. Вивчали вплив зниженої температури (4ºС) не тільки для передобробки ініціального матеріалу, а і тривалого культивування експлантів – 60 днів. В роботі визначали приживлюваність експлантів, динаміку калюсогенезу та ембріогенезу.

При удосконаленні методу культури недозрілих насіннєвих зародків in vitro вихідним матеріалом були грона винограду дослідних сортів із яких виділяли насіннєві зародки, одержані при вільному запиленні та від 4-х варіантів схрещувань (проводили співробітники відділу селекції інституту). Вивчали різні строки ізолювання експлантів: на 20, 30–40, 50–60 день після початку цвітіння. Використовували методичні розробки Н.П. Дорошенко (1999), І.О. Павлової (2003). Для визначення оптимального складу і концентрацій фітогормонів було апробовано 6 варіантів поживних середовищ на основі МС. В подальшій роботі було апробовано середовище Уайта та МС із встановленою кількістю 6-БАП. Досліджували вплив знижених температур +4°С – +5°С в темряві на протязі 90 діб культивування на процеси приживлюваності, калюсогенезу, ембріогенезу та прямого проростання недозрілих насіннєвих зародків in vitro. Одержані адаптовані рослини-регенеранти передавали у відділ селекції для подальшого вивчення.

Для розробки прийомів та методів підвищення ефективності клонального мікророзмноження винограду in vitro вихідним матеріалом були зелені пагони, відібрані із здерев'янілих чубуків дослідних сортів та клонів після пророщування. Для введення в культуру in vitro виділяли меристемні верхівки з листковими зародками розміром 1,5 – 2,5 мм, одновічкові мікрочубуки розміром 0,5 – 1,0 см в залежності від варіанту досліду. Використовували методичні рекомендації П.Я. Голодриги із спів. (1986), Т.М. Череватої (2006), а також розроблені нами: Н.М. Зеленянська, Л.В. Джабурія, Н.І. Теслюк (2009). З метою оптимізації складу поживного средовища досліджували 4 варіанти середовищ: Ніча і Ніч, Гамборга, МС та МС модифіковане шляхом зміни якісного та кількісного складу вітамінів, сахарози, фітогормонів (Патент України № 47417, 2002) та желюючих компонентів. Для удосконалення методу індукції множинних пагонів винограду in vitro перелічені вище поживні середовища готували рідкими (без вмісту агару), напіврідкими (4 г/л агару) та твердими (8 г/л агару) і додавали до усіх експериментальних середовищ 1 мг/л 6-БАП. В ході досліджень проводили облік приживлюваності експлантів (%), початку проліферації бруньок (дні), ризогенезу (дні) та кількості утворених пагонів (шт.).

Математичне планування та обробку одержаних даних проводили за методикою Б.О. Доспєхова (1979), Е.М. Менчера, А.Я. Земшмана (1986) із використанням комп'ютерних статистичних програм Excel. На заключному етапі аналізу одержаних результатів було застосовано метод многокритеріальної оптимізації та парето-оптимальності (В.Д. Ногін, 2005) у сукупності досліджуваних показників.

Удосконалення методів культури винограду in vitro для селекції

Розробка нових прийомів культури пиляків винограду in vitro

Для удосконалення методу культури пиляків in vitro нами було вивчено вплив типу поживного середовища, температурного режиму культивування на приживлюваність експлантів, процеси калюсогенезу та ембріогенезу. Як показали результати досліджень, тип поживного середовища впливає на приживлюваність пиляків винограду, що досліджувались. При культивуванні експлантів при температурі 25ºС найбільш висока приживлюваність пиляків була відмічена на середовищі Уайта. На середовищі Гамборга приживлюваність ініціальних експлантів була задовільною, а поживне середовище Ніча і Ніч виявилось малопридатним для культури пиляків in vitro.

При культивуванні пиляків винограду в умовах знижених температур (4ºС) в темряві були виявлені аналогічні закономірності залежності показника приживлюваності ініціальних експлантів від типу поживного середовища. Всі дослідні сорти показали найвищий показник приживлюваності на поживному середовищі Уайта. На цьому середовищі у сорту Оригінал приживлюваність складала 76,6 %, у сорту Аркадія – 83,3 %, а у Каберне Совіньйон – максимальне значення – 90,0%.

Культивування експлантів при температурі 4ºC у темряві на протязі 60 днів підвищувало приживлюваність пиляків в середньому на 19,0% на всіх варіантах поживних середовищ і на 28,5 % на середовищі Уайта. На 25–30 день після початку культивування спостерігали індукцію калюсогенезу. Виявилось, що морфогенетична характеристика калюсів і утворення ембріоїдів залежали від складу поживного середовища та температурного режиму культивування. Культивування при зниженій температурі призвело до збільшення продукування ембріогенних калюсів з наступною регенерацією проростків в середньому по сортах на 4,3%. Найкращі результати були отримані на середовищі Уайта і складали 10,7% (температура 25ºС) та 15,0% (температура 4ºС). На нашу думку, посилений амінокислотний та вітамінний склад середовища Уайта сприяв покращенню показників приживлюваності, швидкому росту тканин експлантів та їх морфогенетичній диференціації в порівнянні з іншими поживними середовищами. За результатами досліджень було виявлено сортову специфічність культури пиляків in vitro. Різні сорти винограду по-різному відкликаються на культуру пиляків in vitro, по-різному реагують на тип поживного середовища та умови культивування. Найбільш продуктивними виявились сорти Каберне Совіньйон і Аркадія. Так, при знижених температурах в середньому по середовищах у сорту Каберне Совіньйон було отримано 9,1% ембріогенних калюсів, у сорту Аркадія – 8,8 % та у сорту Оригінал – 4,1%.

Таким чином, в результаті досліджень встановлена можливість одержання продуктивних ембріогенних калюсів із пиляків винограду різних сортів. Вперше на первинних етапах культивування пиляків в культурі in vitro вивчено вплив температури 4ºС. Встановлено оптимальність поживного середовища Уайта та його позитивний вплив на основні процеси культури пиляків винограду in vitro. Рекомендовано комплексне використання поживного середовища Уайта та зниженої температури (4ºС) на первинних етапах культивування експлантів.

Культура недозрілих насіннєвих зародків винограду in vitro

Відомо, що для культури насіннєвих зародків in vitro одним із факторів успіху є вдалий підбір поживного середовища. Ми вивчали вплив поживних середовищ МС та Уайта. Встановлено, що при культивуванні ініціальних експлантів при температурі 25ºС та в умовах знижених температур (4ºС) найкращим було поживне середовище Уайта (табл. 1). На цьому середовищі у більшості варіантів приживлюваність ініціальних експлантів перевищувала 90%. При використанні середовища Уайта в порівнянні з МС + 6-БАП, кількість ініціальних експлантів, що прижилися, збільшилась: у сорту Кишмиш лучистий на 7,11%; у сорту Мєчта на 9,44%; у сорту Аркадія на 8,22%.