ВПЛИВ ФАКТОРІВ КРІОКОНСЕРВУВАННЯ НА МОРФОФУНКЦІОНАЛЬНІ ВЛАСТИВОСТІ ТРОМБОЦИТІВ ЛЮДИНИ

summary

Матеріалом для досліджень були концентрати тромбоцитів (КТ), отримані фракціонуванням донорської крові, заготовленої на консерванті “Глюгіцир” в полімерні контейнери “Гемакон”. Виділення КТ здійснювали двома методами: із збагаченої тромбоцитами плазми (ЗТП) [Волкова Р.И. и др., 1992] та з лейко-тромбоцитарного шару (ЛТШ) [Аграненко В.А. и др., 1991]. Перед проведенням експериментальних досліджень КТ зберігали у контейнерах “Компопласт” до 18 – 24 годин при 22 ± 2 ºC в умовах постійного перемішування зі швидкістю 2 об/хв. У межах 2 – 4 годин після виділення КТ визначали його кількісний склад [Перфильева Е.А. и др., 2003; Ронин В.С., 1983].

У роботі використовували кріопротектори: ДМСО, 1,2-ПД, ДМАЦ, гліцерин (ГЛ), оксиетильований гліцерин зі ступенем полімеризації 5 (ОЕГn=5), очищені та ідентифіковані у відділі кріопротекторів ІПКіК НАН України. З метою мінімізації осмотичного стресу додавання розчинів кріопротекторів до КТ у співвідношенні 1:1 здійснювали при 22 ± 2 ºC у відповідності до рекомендованих схем [A aud F.G. et al., 1990; Компаниец А.М., 1992; 1995; Woods E.J. et al., 1999]. Дослідження здатності кріопротекторів до перехоплення гідроксильних радикалів у модельній системі їх генерації проводили за методом [Halliwell B. еt al., 1987]. Визначення вмісту гідроперекисів ліпідів (ГПЛ) у системах “тромбоцити-плазма” та “тромбоцити-плазма-кріопротектор” здійснювали за методом [Asakawa J., 1980]. Кінцеві концентрації ДМСО, ДМАЦ, 1,2-ПД, ГЛ складали 0,5; 0,7 та 1 М; ОЕГn=5: 0,25 та 0,125 М; час експозиції КТ з кріопротекторами – 5; 15; 30 хвилин. Інтенсивність індукованого іонами заліза ПОЛ у системі “тромбоцити-плазма” та “тромбоцити-плазма-кріопротектор” визначали за методом [Владимиров Ю.А., 1972] одразу після введення індуктора та через 15 і 30 хвилин. Кінцева концентрація ДМСО, ДМАЦ, 1,2-ПД, ГЛ складала 0,7 М; ОЕГn=5: 0,25 та 0,125 М.

Морфофункціональні властивості тромбоцитів: здатність накопичувати АО [Деменко В.Д. и др., 1990], здатність до індукованої АДФ та колагеном агрегації [Bo G.V.R., 1962], реакцію на гіпотонічний шок (РГШ) [Компаниец А.М., 1992] досліджували у межах 2 – 4 годин після виділення КТ та після 18 – 24 годин зберігання, а також після експозиції КТ з ДМСО, 1,2-ПД, ДМАЦ у кінцевих концентраціях 0,7 та 1,4 М протягом 5; 30 хвилин і наступного видалення кріопротекторів розробленим способом [Пат. № 15014 Україна, 2006]. Агрегаційну здатність тромбоцитів додатково визначали у присутності вищезазначених кріопротекторів у кінцевій концентрації 0,1 М. Ступінь пошкодження кров’яних пластинок на етапах виділення та зберігання КТ визначали за активністю у супернатанті ферменту лактатдегідрогенази (ЛДГ) [Лемешко В.В. и др., 1989]. Ступінь пошкодження тромбоцитів на етапі експозиції КТ з кріопротекторами визначали за активністю у супернатанті ферментів: ЛДГ та Г6ФДГ [Родионова В.Л. и др., 2005]. Кінцеві концентрації ДМСО, 1,2-ПД, ДМАЦ складали 0,7 М, а комбінацій ДМАЦ + 1,2-ПД: 0,7 та 0,35 М; час експозиції КТ з кріопротекторами та їх комбінаціями становив 15 хвилин.

Кріозахисні розчини (1,4 М ДМСО, ДМАЦ, 1,2-ПД, ДМАЦ + 1,2-ПД та 0,7 М ДМАЦ + 1,2-ПД на плазмі, плазма без кріопротектора) вводили в КТ у співвідношенні 1:1 при 22 ± 2 ºC протягом 1 хвилини, одразу після чого здійснювали заморожування зразків за допомогою програмного заморожувача “Cryoson” (Німеччина) у кріоампулах “Nunc”. Об’єм зразка становив 1,6 мл.

При порівняльному дослідженні ефективності кріоконсервування КТ, виділених з донорської крові двома методами, застосовували ДМСО у кінцевій концентрації 0,7 М та програму заморожування №1.

При дослідженні впливу процедури заморожування КТ в температурному інтервалі кристалізації (від 0/-1,5 до -35…-40 °C) на показники структурної цілісності і функціональних властивостей кріоконсервованих тромбоцитів застосовували наступні програми:

програму №1: охолодження зразка від 22 ± 2 °C до -35…-40 °C проводили зі швидкістю 1°C/хв, після чого – занурювали у рідкий азот;

програму №2: зразок охолоджували аналогічно програмі №1, але додатково вводили процедуру температурної ініціації кристалізації, після чого застосовували контрольовану швидкість охолодження 6 – 7 °C/хв;

програму №3: охолодження зразка проводили аналогічно програмі №2, але після процедури температурної ініціації кристалізації зменшували швидкість його охолодження до 0,2 – 0,3 °C/хв.

Заморожування зразків за зазначеними програмами здійснювали з кріопротектором та без нього. При застосуванні програм, що передбачали процедуру температурної ініціації кристалізації, величина переохолодження не перевищувала 0,5 – 1 °С.