В огляді літератури висвітлено значення картоплі в народному господарстві, основні хвороби картоплі, в тому числі карантинні, серед яких найнебезпечнішою є рак (збудник хвороби — Synchytrium endobioticum (Schilb.) Perc.). Показано біологічну спеціалізацію збудника раку та внутрішньовидову мінливість гриба. Дано характеристику патотипів збудника раку картоплі. Висвітлено методи виявлення, диференціації та ідентифікації патогену, основні біохімічні показники рослин у нормі та при ураженні хворобами, а також методи визначення стійкості рослин до патогенів.
У роботі використовували стійкі до збудника раку сорти картоплі: Темп, Невська, Луговська, Барбара і представників диких видів: Solanum demissum, Solanum stoloniferum, Solanum rybinii, Solanum chacoense та сприйнятливі до раку сорти: Вале, Поліська рожева, гібрид П 85 145-5; вихідні батьківські форми картоплі Гитте, Поліська рожева, а також гібриди, отримані після різних комбінацій схрещування, представлені Інститутом картоплярства УААН, а також Поліською дослідною станцією ІК УААН; ракові нарости, отримані після зараження cприйнятливих сортів картоплі. Для зараження використовували зооспорангії звичайного патотипу збудника раку картоплі та 4-х агресивних: 11 — Міжгірського, 13 — Рахівського, 18 — Ясинського та 22 — Бистрецького патотипів збудника хвороби.
. Білки виділяли за методом Гааль Е., Медьєші Г. та Верецького Л. (1982). Їх вміст визначали за методом Bradford T (1986). Як стандарт використовували сироватку бика .
Поліморфізм білків контрастних за ракостійкістю сортів картоплі, у процесі патогенезу, а також патотипів збудника раку картоплі вивчали методом ізоелектрофокусування при використанні амфолінів з інтервалом pH 3,5—10,0 ( Рігетті Т., 1986) на приладі АГГЕ—3 фірми “Хійу Калур” в ПААГ при Т = 5%, С = 3%. Для розділення білків використовували буферні розчини, кислоти і луги. Білкові екстракти ізоелектрофокусували протягом 2-х годин при напрузі 600 В і силі струму 15 мА. Гелі фіксували в 15% ТХО кислоті і фарбували 0,5% розчином Coomassie blue G—250 на суміші ТХО : етанол : вода (10 : 25 : 65) протягом 30 хвилин. Розрахунок білкових компонентів проводили за допомогою комп’ютерної програми, удосконаленою співробітниками УкрНДСКР (2008).
Амінокислотний склад білків сортів картоплі, а також заражених рослин збудником раку вивчали за методом Плешкова Б.П. (1986) на амінокислотному аналізаторі JLC—6 фірми JEOL (Японія).
Гідроліз білків проводили з 6 н HCl протягом 24 годин при 105˚С у співвідношенні кислоти до білка 100 : 1 в запаяних ампулах. Хроматографію амінокислот проводили, використовуючи 0,2 н Na-цитратний буфер pH 3,25, 0,25 н Na-цитратний буфер pH 4,25 і 0,35 н Na-цитратний буфер pH 5,28, фарбували нінгідриновим реактивом. В якості стандарту використовували стандартний розчин амінокислот і отримали стандартну хроматограму, за винятком триптофану.
Визначення триптофану проводили окремо, оскільки при кислотному гідролізі він руйнується. Зразки білків розчиняли в 0,2 н NaOH при слабкому нагріванні, додавали 23,7 н сірчану кислоту + 0,03% парадиметиламінобензольдегід і заливали на 12 годин. Потім додавали 0,1 мл 0,045%-ного розчину азиду натрію і після 30 годин визначали оптичну щільність на спектрофотометрі СФ—26 при 600 нм. Для контролю брали воду.
Статистичну обробку отриманих даних проводили за методом Ю.І. Маслова (1988).
Метод 1. Визначення стійкості сортів та гібридів картоплі до збудника хвороби проводились методом Салтикової Л.П. та Яковлевої В.І. (1982) прямого зараження зразків зооспорангіями від свіжих ракових наростів. Зразки бульб картоплі у фазі, коли паростки досягали 1 — 2 мм заражали літніми зооспорангіями протягом 24 годин при 11 — 13˚С. Для цього на верхівку бульби картоплі навколо паросткової частини закріплювали паперове кільце за допомогою суміші парафіну та вазеліну (1 : 0,5). В кільце наливали дистильовану воду, клали свіжі ракові нарости розміром 0,5 см3. Зразки залишали в клімокамері з підвищеною вологістю і температурою 11 — 13˚С. Час експозиції 24 години. Інфекцію з паперовими кільцями знімали з бульб, а зразки залишали в темряві на 21 добу при температурі 17 — 18˚С до прояви симптомів захворювання. На 21-й день проводили облік уражених бульб картоплі. Для діагностики використовували 3 ступені (групи) оцінки.
Метод 2. Визначення ракостійкості картоплі за допомогою білкового екстракту, виділеного з ракових наростів, відокремлених від рослин сприйнятливих сортів картоплі проводили за методикою, запропонованою Яковлевою Н.М. та Кадирматовим І.Н. (1973). При цьому ракові нарости розтирали у фарфоровій ступці з рівним об’ємом калій-фосфатного буфера, який містив 12,5% глюкози, 1% аскорбінової кислоти, 1% метабісульфіту калію та 0,018% MgCl2, pH 7,4. Гомогенат витискали крізь капронову сітку і центрифугували 25 хвилин при 12000 об./хв. При цьому білки виділялися у супернатанті, а залишки випадали в осад. Супернатант очищали через колонку із сафадексом G—25, врівноваженим буфером, який вміщував 4,66% трису; 0,59% ЕДТА-натрію та 0,3 г борної кислоти, pH 8,6. Екстрактом заражали листки картоплі.Облік проводили на 21 день після зараження екстрактом за 3-х бальною шкалою.
Метод 3. Визначення ракостійкості картоплі методом інфрачервоної спектроскопії проводили таким чином: зразки картоплі заспорювали літніми зооспорангіями зі свіжих ракових наростів, як було вказано вище . З уражених бульб на 21-й день після зараження паростки поміщали у кювети і аналізували на інфрачервоному аналізаторі ІФА—61. При аналізі використовували довжину хвиль 1510 нм. З метою підвищення точності аналізу за результат брали середнє із трьох значень, отриманих при повороті кювети на 90˚. Ступінь стійкості картоплі до збудника раку визначали за формулою:
 ,
де: К — константа градуйованого рівняння;
ОГ — оптична густина при (W) — аналітична довжина хвилі (1510 нм);
У — ступінь стійкості зразків картоплі до збудника раку (в %).
Метод 4. З паростків різних сортів картоплі а також з ракових наростів виділяли білковий екстракт таким чином: 2 г наростів подрібнювали і розтирали з 2 мл 5М боратним буфером (рН 8,4), . Гомогенат віджимали крізь капронову сітку і центрифугували 10 хвилин при 12000 об/хв. При цьому білки виділяються в супернатанті, а залишки випадали в осад. Супернатант 7 мл очищують через колонку з сефадексом G – 25, врівноважену буфером, який вміщував той же боратний буфер (рН 8,4).Після початку виходу білка відбирали 2 – 3 мл і зберігали в холодильнику при 4 – 6 °С. Для визначення ступеню індукованої преципітації при утворенні комплексів рослина-хазяїн-патоген додавали рівну кількість (1мл) білкового екстракту з рослин картоплі + екстракт з ракового наросту + 4% розчин поліетиленгликолю і при температурі 18 С на протязі 1 години визначають утворення комплексів. На спектрофотометрі “Ломо-26” при довжини хвилі 450нм визначали величину пропускання світла Р (в %) за формулою: Р= Ро - Рк (Рпег – Рбуф.) де Р – підсумковий результат проби в відсотках пропускання світла, або одиниця оптичної щільності, Ро – відсоток пропускання світла дослідного зразка, Рк – контрольної, Р пег – 40 поліетиленгликолю та величину екстинкції: Е = -lg P. Концентрацію комплексів (в г/л) визначали за формулою Е= кС, де Е – величина екстинкції, к – коефіціент пропускання світла, С – концентрація комплексу білка рослина-живитель-патоген.
Розробка методів виявлення та диференціації патотипів збудника раку. Проби зразків грунту для виявлення зооспорангіїв збудника раку картоплі відбірали за схемою конверту, квадрату, трикутника та човника. Виявлення патогену проводили за методом Шарикова К.Е.(1964) - флотацією в розчині чотирьоххлористого вуглеця, Голика І.В. (1974) – флотацією в суміші чотирьоххлористого вуглеця та ефіру для наркозу (2:1), Володимирської Н.М.(1978) - флотацією у діброметані, Яковлевої В.О.(1984)- флотацією в чотирьоххлористому вуглеці та фарбуванням в бромистому етідію та розробленим експрес- методом флотації в 48,5% розчині натрію йодистого (Зеля А.Г.,2006). Диференціацію патотипів збудника хвороби проводили способом ізоелектрофокусування білків в поліакриламідному гелі в градіенті рН 3.5 – 10.0 (Сологуб О.С., 2006), визначенням вмісту білка у різних патотипів збудника раку (Зеля А.Г., Мельник П.О., 2006) та методом індукованої преципітації тест-сортів картоплі та патотипів збудника хвороби.
Аналіз стійкості вихідних батьківських форм картоплі та їх гібридів проти збудника раку.
В результаті проведених досліджень з вивченню реакції вихідних батьківських форм картоплі та гібридів, отриманих після їх схрещування виявлено (рис.1), що в випадку використання комбінації за схемою: сприйнятливий х стійкий (Поліська рожева х Гітте), отримано 54% стійких проти раку гібридів.
У випадку використання комбінації схрещування батьківських вихідних форм за схемою: стійкий х сприйнятливий (Гітте х Поліська рожева) отримано 56% стійких до раку нащадків картоплі. В даних випадках сорт картоплі Гітте є представником диких видів картоплі Solanum demissum і є гексаплоїдом (6n). Сорт картоплі Поліська рожева є представником культурного виду Solanum tuberosum і є тетраплоїдом (4n).
У випадку використання комбінації схрещування за сх емою: стійкий х стійкий (Гітте х П 88 128-7), з яких одна батьківська форма отримана в результаті схрещування диких видів отримано 100% стійкого проти раку селекційного матеріалу картоплі (рис.3). При схрещуванні сортів культурних видів отримано 100% стійких проти раку гібридів
Рис. 3. Вихід стійких проти раку гібридів картоплі, отриманих після схрещування батьківських форм стійкий х стійкий (Гітте х.П 88 128-7).
У разі використання для схрещування комбінації схрещування за схемою: сприйнятливий х сприйнятливий, отримано 6% стійкого селекційного матеріалу картоплі. У нашому випадку такими представниками стали сприйнятливий до раку сорт Поліська рожева та гібридП85 145-5 (рис.4).
Результати отримані на основі експериментальних досліджень проведених в лабораторних та польових умовах 2002-2004рр. в лабораторії карантину рослин УкрНДСКР і польовому стаціонарі.
Отже, найбільший вихід стійких гібридів картоплі спостерігалось при використанні вихідних батьківських форм представників Solanum demissum, що також виявлено Хютті О.В. (2008).
Вивчення вмісту та поліморфізму білків картоплі
У результаті вивчення вмісту білків у аналізованих видів і сортів картоплі виявлено 212,6—523,2 мкг/г загального білка (рис. 5).
У зразків картоплі представників диких видів виявлено до 523.2 мкг/г загального білка. У представників культурних видів картоплі вміст білка коливався у межах 212.6 – 230.0 мкг/г.
У результаті проведеного ізоелектрофокусування білків в ПААГ стійких та сприйнятливих до хвороби сортів картоплі, виявлено, що у всіх досліджуваних стійких сортів і видів та сприйнятливих сортів картоплі різна кількість білкових компонентів. Вона коливається у межах 32—54 компонентів. Кожний сорт картоплі відрізняється своїм білковим набором.
Отримані нами результати вивчення відмінностей білкового складу різних за ракостійкістю сортів картоплі узгоджуються з дослідженнями Голика І.В. (1974), Деревенко О.С. (1986), Кадирматова І.Н. (1993).
У ряді праць з порівняльного вивчення поліморфізму білків різних за стійкістю до хвороб рослин установлено також різницю між ними за цим біохімічним показником (Громова Б.Б., Шопина О.В., Патрикеева М.В., 1992).
Амінокислотний склад білків картоплі
У зв’язку з тим, що нами знайдено відмінності у складі білкових компонентів контрастних за ракостійкістю сортів картоплі доцільно провести аналіз їх амінокислотного складу. Для дослідження використовували білкові екстракти паросткової частини бульб картоплі високостійкого до звичайного та агресивних патотипів збудника раку сорту Божедар і сприйнятливого до всіх патотипів збудника хвороби сорту Поліська рожева.
Порівняльна оцінка амінокислотного складу білків даних сортів дозволила виявити їх схожість ( рис. 7) за кількістю двоосновних амінокислот (лізину, гістидину й аргініну). Із амінокислот, що містять сірку, був виявлений цистеїн і цистін.
Зафіксовано присутність треоніну і серину (4.5 та 5.0%), а вміст гліцину, аланіну був майже однаковий у даних сортів картоплі. Для них характерна велика кількість дикарбонових амінокислот: глютамінової, аспарагінової. Іх кількість відповідно складає 11,0% і 10,6% у сорту Божедар і 9,0% і 10,8% у сорту Поліська рожева. Аналізуючи склад незамінних амінокислот - лізину, треоніну, метіоніну, лейцину, ізолейцину, валіну, триптофану і фенілаланіну, які входять до складу білків картоплі, можна побачити значну різницю: їх
сума у стійкого проти збудника раку сорту картоплі Божедар становите
41,6%, а у сприйнятливого до раку сорту Поліська рожева — 43,8%. Вміст амінокислот зростає в основному за рахунок триптофану і незначно — фенілаланіну, лізину. лейцину, ізолейцину. У сприйнятливого проти раку сорту картоплі Поліська рожева вміст амінокислот вищий, ніж у стійкого сорту Божедар. Відомо, що картопля тим і ціниться, що вона містить важливі для людини всі 8 незамінних амінокислот, хоча уражається інтенсивно раком картоплі та іншими збудниками хвороб і шкідників.
Ліпсиц Д.В. (1987), аналізуючи білковий склад сортів картоплі, а також вміст амінокислот стійких і сприйнятливих сортів методом хроматоелектрофорезу виявив у сприйнятливого до раку сорту більше амінокислот, ніж у стійкого.
Мельником П.О. (2003) отримано аналогічні результати при вивченні амінокислотного складу різних за ракостійкістю сортів картоплі.
Нашими дослідженнями уточнено амінокислотний склад білків у контрастних за ракостійкістю сортів картоплі на сучасному амінокислотному аналізаторі, який дозволяє більш точно визначити вміст кожної амінокислоти. Це дає змогу детальніше вивчити, як відрізняються ці показники при зараженні картоплі збудником раку. Тому наступним етапом досліджень було вивчення ролі білків у стійкості рослин проти збудника раку.
Вивчення вмісту та поліморфізму білків картоплі у процесі патогенезу
Відомо, що найбільш чутливим до дії різних факторів на рослину, в т. ч. патогенів, є білки. Тому наступним етапом вивчення з біохімічних показників був аналіз вмісту та поліморфізму білків шляхом їх ізоелектрофокусування у ПААГ при зараженні контрастних за ракостійкістю сортів картоплі Поліська рожева (сприйнятливий до раку) та Божедар (стійкий до патогену).
При визначенні вмісту білка контрастних за ракостійкістю сортів картоплі Поліська рожева та Божедар у процесі їх зараження збудником раку на 21-у добу у сорту Поліська рожева виявлено зменшення загальної кількості білка від 223,4 до 202,3 мкг/г, а у сорту Божедар — збільшення від 329,8 до 356,3 мкг/г.(Рис.8).
Отримані результати з вивчення поліморфізму білків у процесі патогенезу збудника раку картоплі вказують на те, що у пухлинних клітинах відбувається не тільки змінений біосинтез білків, на що вказували експерименти Ліпсица Д.В. (1974), Голика І.В. (1974), але і якість синтезованих білків змінена.
При зараженні стійкого до раку картоплі сорту Божедар у білковому спектрі з’являються додаткові білкові компоненти на 14-у добу (цьому періоду дорівнює цикл розвитку патогену у рослини-живителя), що можна пояснити тим, що ці поліпептиди є стресовими або патогенозалежними білками рослини-хазяїна, які виконують захисну функцію рослини при ураженні її патогеном.
При зараженні сприйнятливого до раку сорту картоплі Поліська рожева у білковому спектрі зменшується кількість білкових компонентів до 28 (на 21-у добу після зараження).
У літературі є небагато оглядів про білки, що виконують захисну функцію (Горбачова Л.Д., Дударєва Н.А., Салганик Р.І. (1991) при дії на рослини різних факторів. Стресові або патогенозалежні білки (PR-білки) не є нормальними компонентами здорових клітин, а якщо містяться в нативній тканині, то у залишковій кількості. Відомо, що PR-білки володіють деякими загальними властивостями: низькою молекулярною масою, крайніми ізоелектричними точками, високою стійкістю до дії протеїназ, локалізацією їх у позаклітинному просторі та здатністю екстрагуватися при низьких значеннях pH. Є також дані, що в деяких рослинних PR-білків виявлено хітиназну та глюконазну активність, а хітин і глюкани, як відомо, — це компоненти, що входять до складу покривних тканин фітопатогенів. Можливо, існують ще інші, поки що невідомі функції і механізми дії PR-білків, пов’язаних зі стійкістю рослин до хвороб. Синтез заново і накопичення великої кількості низькомолекулярних кислих білків у міжклітинному просторі зумовлює зміну властивостей зовнішньої частини і має фізіологічне значення, а також відіграє певну роль у взаємодії клітин, метаболізмі та захисті клітинної стінки.
Зникнення компонентів поліпептидів при ураженні сорту картоплі Поліська рожева на 14-ту (рис.9,2) і 21-ю добу (рис.9,3) після зараження її збудником раку - характерне при зараженні патогеном (рис. 8).
Поява додаткових білкових фракцій при зараженні стійкого до раку сорту картоплі Божедар патогеном на 14-ту(рис.9,5) і 21-у добу (рис.9,6) після зараження поясняється синтезом стресових білків .
Отримані дані узгоджуються із проведеними дослідженнями інших авторів. У ряді праць із порівняльного вивчення стресових білків при дії на рослини різних факторів та фітопатогенів також установлено певні відмінності за їх фракційним складом (Григорюк І.П. (1996), Шматько І.Г., Шведова О.В. (1989), Лісовий М.П., Сігарьова Д.Д., Сова В.М. (1996)). Ці автори рекомендують використовувати методику виявлення або аналізу PR-білків як експрес-метод діагностики ураження патогенами, а виявлення стресових або PR-білків — як біохімічні маркери стійкості до хвороб. | 
