ДОСЛІДЖЕННЯ ДЕЯКИХ АНТИМІКРОБНИХ КОНСЕРВАНТІВ З МЕТОЮ СТАНДАРТИЗАЦІЇ СКЛАДІВ М’ЯКИХ ЛІКАРСЬКИХ ЗАСОБІВ НА ГІДРОФОБНИХ ОСНОВАХ

brief description

МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ’Я УКРАЇНИ
ДЕРЖАВНЕ ПІДПРИЄМСТВО
«ДЕРЖАВНИЙ НАУКОВИЙ ЦЕНТР ЛІКАРСЬКИХ ЗАСОБІВ»

На правах рукопису

ДУНАЙ ОЛЕНА В’ЯЧЕСЛАВІВНА

УДК 615.454.14.076

Дослідження деяких антимікробних консервантів
з метою стандартизації складів м’яких лікарських засобів
на гідрофобних основах

15.00.03 стандартизація і організація виробництва лікарських засобів

Дисертація
на здобуття наукового ступеня кандидата фармацевтичних наук

Науковий керівник:
Ляпунов Микола Олександрович,
доктор фармацевтичних наук,
професор

Харків 2008

ЗМІСТ

ПЕРЕЛІК УМОВНИХ СКОРОЧЕНЬ 5
ВСТУП 6
РОЗДІЛ 1 СУЧАСНІ АСПЕКТИ ЗАСТОСУВАННЯ ТА ДОСЛІДЖЕННЯ АНТИМІКРОБНИХ КОНСЕРВАНТІВ В М’ЯКИХ ЛІКАРСЬКИХ ЗАСОБАХ 11
1.1 М’які лікарські засоби на гідрофобних основах та їх застосування в дерматології 11
1.2 Загальна характеристика антимікробних консервантів для лікарських
засобів 14
1.2.1 Основні вимоги до антимікробних консервантів 15
1.2.2 Класифікація антимікробних консервантів 15
1.2.3 Механізми дії антимікробних консервантів 24
1.2.4 Чинники, що впливають на ефективність антимікробних
консервантів 26
1.3 Мікробіологічні методи дослідження ефективності антимікробних консервантів в м’яких лікарських засобах 30
ВИСНОВКИ 35
РОЗДІЛ 2 ОБ’ЄКТИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ 37
2.1 Об’єкти досліджень 37
2.2 Тест-мікроорганізми 38
2.3 Методи досліджень 42
2.3.1 Дослідження ефективності антимікробних консервантів 42
2.3.2 Перевірка придатності методики визначення числа
життєздатних клітин тест-мікроорганізмів в м’яких лікарських
засобах 44
2.3.4 Вивчення антимікробної дії методом дифузії в агар 45
РОЗДІЛ 3 СТАНДАРТИЗАЦІЯ МЕТОДІВ ДОСЛІДЖЕННЯ ЕФЕКТИВНОСТІ АНТИМІКРОБНИХ КОНСЕРВАНТІВ В М’ЯКИХ ЛІКАРСЬКИХ ЗАСОБАХ НА ГІДРОФОБНИХ ОСНОВАХ 47
3.1 Обґрунтування процедури підготовки зразка при визначенні числа життєздатних клітин бактерій та грибів в м’яких лікарських засобах на гідрофобних вазелінових основах 48
3.1.1 Розробка методики підготовки зразка 48
3.1.2 Порівняльний аналіз розробленої методики і стандартної методики Державної Фармакопеї України 51
3.2 Розробка стандартизованої процедури випробування ефективності
антимікробної консервуючої дії для м’яких лікарських засобів
на гідрофобних основах 57
3.2.1 Процедура випробування 57
3.2.2 Обґрунтування придатності розробленої процедури 58
ВИСНОВКИ 63
РОЗДІЛ 4 ДОСЛІДЖЕННЯ ЕФЕКТИВНОСТІ АНТИМІКРОБНОЇ КОНСЕРВУЮЧОЇ ДІЇ ДЕЯКИХ ГРУП КОНСЕРВАНТІВ В ГІДРОФОБНИХ ВАЗЕЛІНОВИХ ОСНОВАХ 65
4.1 Перевірка придатності методики визначення життєздатних клітин бактерій та грибів в інокульованих зразках гідрофобних вазелінових основ 66
4.2 Вивчення стійкості до мікробної контамінації гідрофобних вазелінових основ, що не містять антимікробних консервантів 69
4.3 Вивчення антимікробної консервуючої дії парабенів 70
4.4 Вивчення антимікробної консервуючої дії спиртів 83
ВИСНОВКИ 87
РОЗДІЛ 5 МІКРОБІОЛОГІЧНЕ ОБҐРУНТУВАННЯ І СТАНДАРТИЗАЦІЯ СКЛАДУ М’ЯКИХ ЛІКАРСЬКИХ ЗАСОБІВ У ФОРМІ МАЗЕЙ НА ГІДРОФОБНИХ ВАЗЕЛІНОВИХ ОСНОВАХ 89
5.1. Дослідження впливу допоміжних речовин на ефективність антимікробної консервуючої дії крему з мометазону фуроатом 0.1% на гідрофобній емульсійній основі 89
5.1.1 Перевірка придатності методики визначення життєздатних клітин бактерій та грибів в інокульованих зразках крему з мометазону фуроатом 90
5.1.2 Дослідження ефективності антимікробних консервуючої дії в кремі з мометазону фуроатом 0.1% 92
5.2 Порівняльне дослідження антимікробної дії розроблених мазей з бетаметазону дипропіонатом та інноваційних препаратів 96
5.2.1 Перевірка придатності методик визначення числа життєздатних клітин тест-мікроорганізмів 98
5.2.2 Дослідження антимікробної дії препарату Акридерм, мазь 105
5.2.3 Дослідження антимікробної дії препарату Акридерм-Гента, мазь 109
5.2.4 Дослідження антимікробної дії препарату Акридерм-ГК, мазь
і Трикутан, мазь 115
ВИСНОВКИ 126
ЗАГАЛЬНІ ВИСНОВКИ 128
ЛІТЕРАТУРА 130

ПЕРЕЛІК УМОВНИХ СКОРОЧЕНЬ
ЛЗ лікарський засіб
ДФУ Державна Фармакопея України, 1 видання
ЄФ Європейська Фармакопея
МЛЗ - м'які лікарські засоби
КУО колонієутворююча одиниця
ІПМ ізопропілміристат
ПС-80 полісорбат-80
ФБР фосфатний буферний розчин з натрію хлоридом і пептоном рН 7.0
КС кортикостероїди
ПАР поверхнево-активні речовини
МІК мінімальна інгібуюча концентрація

ВСТУП
Актуальність теми. Проблема лікування дерматозів є однією з пріоритетних у сучасній дерматології. Зокрема, в останні роки в Україні спостерігається підвищення рівня захворювання на дерматози із зростанням кількості тяжких клінічних форм, для яких характерно зменшення тривалості терміну ремісії та низький індекс одужання хворих. На сьогодні тактика лікування дерматозів передбачає, перш за все, застосування лікарських засобів для зовнішнього застосування, що включають різні комбінації кортикостероїдів і речовин протимікробної дії. При хронічних дерматозах, які супроводжуються сухістю, лущенням, ліхенізацією, застосовують мазі на гідрофобних основах, що забезпечують відповідність медико-біологічним вимогам до препаратів для зовнішнього лікування таких захворювань шкіри. Розробка якісних, ефективних та безпечних м’яких лікарських засобів (МЛЗ) для лікування цих дерматологічних захворювань є актуальною проблемою.
Сучасні вимоги до якості МЛЗ знайшли своє відображення в Державній Фармакопеї України (ДФУ), яка гармонізована з Європейською Фармакопеєю (ЄФ). Відповідно до вимог ДФУ, на стадії розробки МЛЗ слід одержати дані, що підтверджують необхідність застосування антимікробних консервантів та ефективність їх дії, від якої залежить захист МЛЗ від мікробного забруднення при виробництві, зберіганні та використанні. Це досягається за рахунок вибору оптимального складу МЛЗ, зокрема антимікробних консервантів, і дослідження ефективності антимікробної консервуючої дії згідно з наведеною в ДФУ методикою.
Традиційно вважають, що в МЛЗ на гідрофобних вазелінових основах не підтримується життєздатність мікроорганізмів, в зв’язку з чим використання антимікробних консервантів в таких МЛЗ нераціонально. Але експериментальне обґрунтування такого положення не знайшло належного відображення в науковій літературі. Таким чином, вивчення антимікробної консервуючої дії гідрофобних основ для МЛЗ, дослідження ефективності різних груп антимікробних консервантів у таких основах та використання результатів досліджень при розробці МЛЗ для дерматології є актуальною проблемою.
Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертація виконана відповідно до плану науково-дослідних робіт ДП«ДНЦЛЗ» за темою: «Біофармацевтичні дослідження в області розробки експериментально-теоретичних основ створення нових лікарських препаратів в оптимальних лікарських формах і контроль їхньої якості» (№ держ.реєстрації0198U00864) та господарчими договорами між ДП«ДНЦЛЗ» та ВАТ «Фармак» (Україна, м.Київ), ВАТ «Київмедпрепарат» (Україна, м.Київ), ВАТ «Хіміко-фармацевтичний комбінат «Акрихін» (Росія, м.Стара Купавна).
Мета та задачі дослідження. Метою дослідження є розробка методологічного підходу до мікробіологічних випробувань при розробці МЛЗ на гідрофобних основах, а також мікробіологічне обґрунтування і стандартизація складів МЛЗ з кортикостероїдами та комбінованих мазей з бетаметазону дипропіонатом і речовинами антимікробної дії.
Для досягнення поставленої мети необхідно було вирішити такі задачі:
· розробити і стандартизувати методику визначення числа життєздатних клітин мікроорганізмів в МЛЗ на гідрофобних основах;
· стандартизувати методологічний підхід до випробування ефективності консервантів в МЛЗ на гідрофобних вазелінових основах;
· експериментально обґрунтувати доцільність досліджень щодо ефективності антимікробної консервуючої дії МЛЗ на гідрофобних вазелінових основах та введення в них антимікробних консервантів;
· вивчити антимікробну консервуючу дію парабенів, а також феноксіетанолу та фенілетилового спирту в гідрофобних вазелінових основах;
· дослідити вплив деяких допоміжних речовин на ефективність антимікробної консервуючої дії кремів з мометазону фуроатом на основі емульсій типу вода/масло;
· обґрунтувати доцільність введення до складу мазей з бетаметазону дипропіонатом на гідрофобних основах антимікробних консервантів з метою стандартизації їх складів та дослідити ефективність консервуючої дії розроблюваних препаратів порівняно з референтними препаратами;
· провести порівняльне вивчення специфічної антимікробної дії комбінованих препаратів в дослідах in vitro.
Об'єкти дослідження. Експериментальні зразки гідрофобних вазелінових основ, що відрізняються складом допоміжних речовин, зокрема антимікробних консервантів; експериментальні зразки крему с мометазону фуроатом, що відрізняються складом допоміжних речовин; розроблювані та референтні лікарські препарати.
Предмет дослідження: Вивчення ефективності антимікробної консервуючої дії МЛЗ на гідрофобних основах, мікробіологічне обґрунтування та стандартизація складів препаратів Акридерм мазь, Акридерм-Гента мазь, Акридерм-ГК мазь, Триакутан мазь та крему з мометазону фуроатом, а також порівняльне дослідження специфічної антимікробної дії комбінованих мазей в дослідах in vitro.
Методи досліджень: Стандартні мікробіологічні методи, методи математичної статистики.
Наукова новизна отриманих результатів. Вперше розроблено і експериментально обґрунтовано методику визначення життєздатних клітин мікроорганізмів в МЛЗ на гідрофобних вазелінових основах.
Розроблено методологічний підхід до випробування ефективності антимікробної консервуючої дії МЛЗ на гідрофобних вазелінових основах.
Обґрунтовано необхідність введення антимікробних консервантів до складу МЛЗ на гідрофобних вазелінових основах.
Обґрунтовано з мікробіологічної точки зору склад крему з мометазону фуроатом на основі емульсії типу вода/масло, а також мазей на гідрофобних вазелінових основах, що містять бетаметазону дипропіонат та бетаметазону дипропіонат в комбінаціях з гентаміцину сульфатом, а також гентаміцину сульфатом і клотримазолом. На склад препаратів мазь Акридерм, мазь Акридерм-Гента, мазь Акридерм-ГК отримано патент Російської Федерації (патент на винахід №2325912).
Практичне значення одержаних результатів. Розроблений препарат «Мометазон, крем 0,1%» зареєстровано МОЗ України (р.№UA/7002/01/01) та впроваджено у виробництво на ВАТ «Фармак» (Україна, м.Київ).
Препарат Триакутан, мазь проходить реєстрацію в Україні і планується до випуску на ВАТ «Київмедпрепарат» (Україна, м.Київ).
Препарати Акридерм мазь, Акридерм-Гента мазь, Акридерм-ГК мазь проходять реєстрацію в Російській Федерації і плануються до випуску на ВАТ «Хіміко-фармацевтичний комбінат «Акрихін» (Росія, м.Стара Купавна).
Особистий внесок здобувача. Особисто автором проведений пошук та аналіз даних літератури з питань запальних захворювань шкіри, використання в клінічній практиці МЛЗ для місцевого застосування на гідрофобних основах, а також необхідність застосування антимікробних консервантів в МЛЗ, основні вимоги, класифікація, механізми дії антимікробних консервантів та чинники, що впливають на їх ефективність, фармакопейні методи дослідження ефективності антимікробних консервантів в МЛЗ. Розроблено і експериментально обґрунтовано методику визначення життєздатних клітин мікроорганізмів в МЛЗ на гідрофобних вазелінових основах. Експериментально обґрунтовано методологічні підходи до випробування ефективності антимікробних консервантів в МЛЗ на гідрофобних вазелінових основах. Проведені мікробіологічні дослідження з метою обґрунтування необхідності введення антимікробних консервантів до складу МЛЗ на гідрофобних вазелінових основах. Експериментально досліджено антимікробну консервуючу дію консервантів з групи парабенів, а також феноксіетанолу та фенілетилового спирту в гідрофобних вазелінових основах. Експериментально досліджено вплив гексиленгліколю та воску білого на ефективність антимікробної консервуючої дії крему з мометазону фуроатом. Проведені мікробіологічні дослідження з експериментального обґрунтування та стандартизації складів препаратів Акридерм мазь, Акридерм-Гента мазь, Акридерм-ГК мазь та Триакутан мазь. Досліджено специфічну антимікробну дію препаратів Акридерм-Гента мазь, Акридерм-ГК мазь та Триакутан мазь порівняно з референтними препаратами.
Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертаційної роботи доповідались на Відкритій науково-практичній конференції молодих вчених і спеціалістів Наукові досягнення в області створення лікарських засобів: технологія, аналіз, фармакологія” (Харків, 2004), Всеукраїнському конгресі Сьогодення та майбутнє фармації” (Харків, 2008).
Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 5наукових робіт, у тому числі: 3статті у наукових фахових виданнях, 1тези доповідей, 1патент.

bibliography

ЗАГАЛЬНІ ВИСНОВКИ
1. Розроблено методику визначення числа життєздатних мікроорганізмів в гідрофобних мазевих основах, яка забезпечує вивільнення з них мікроорганізмів у живильне середовище і дає об’єктивні дані щодо їх мікробіологічного забруднення.
2. Обґрунтовано методологічний підхід до вивчення ефективності антимікробних консервантів в м’яких лікарських засобів на гідрофобних основах, який дозволяє проводити випробування безпосередньо в тубах. Показано рівномірність розподілу мікроорганізмів в випробовуваних зразках з використанням запропонованої процедури інокуляції.
3. Експериментально доведено, що методологічний підхід до фармацевтичної розробки мазей та кремів на гідрофобних основах має включати дослідження ефективності антимікробної консервуючої дії, а за її відсутністю науково обґрунтований вибір антимікробних консервантів для включення в ці м’які лікарські засоби.
4. В мазевих вазелінових основах досліджено ефективність антимікробних консервантів групи парабенів залежно від їх концентрації та хімічної структури, а також феноксіетанолу та фенілетилового спирту. Зазначені оптимальні концентрації консервантів у цих мазевих основах.
5. Експериментально доведено, що гексиленгліколь і, в меншій мірі, віск білий в складі крему з мометазону фуроатом забезпечують ефективність антимікробної консервуючої дії на рівні критеріюА, внаслідок чого введення додаткового антимікробного консерванту стає недоцільним, що було враховано при розробці та стандартизації препарату «Мометазон крем 0,1 %».
6. Розроблені методологічні підходи та отримані експериментальні результати були використані з метою мікробіологічного обґрунтування раціональних складів м’яких лікарських засобів протизапальної та антимікробної дії для дерматології. За результатами мікробіологічних досліджень експериментально обґрунтовані та стандартизовані склади декількох препаратів-генериків у формі мазей на гідрофобних основах: Акридерм, Акридерм-Гента, Акридерм-ГК та Триакутан. Експериментально доведена доцільність додаткового введення до складу препаратів антимікробного консерванту.

7. Показано, що на відміну від референтних препаратів введення антимікробних консервантів до складу м’яких лікарських засобів з кортикостероїдами на гідрофобній основі забезпечує необхідну ефективність антимікробної консервуючої дії, а у разі комбінованих препаратів з бетаметазону дипропіонатом та речовинами антимікробної дії розширює спектр їх антибактеріальної дії та посилює ступінь виразності специфічної антибактеріальної й антифунгальної дії, що проявляється в істотному збільшенні діаметрів зон затримки росту тест-штамів бактерій та грибів порівняно з референтними препаратами. Оригінальність складу мазей Акридерм, Акридерм-Гента і Акридерм-ГК захищена патентом Російської Федерації №2325912.