Эндонуклеазы рестрикции Ssoll, PspGI и Mbol: изучение свойств и определение ДНК-связывающих мотивов Судьина, Анна Евгеньевна

brief description

Судьина, Анна Евгеньевна.
Эндонуклеазы рестрикции Ssoll, PspGI и Mbol: изучение свойств и определение ДНК-связывающих мотивов : диссертация ... кандидата химических наук : 02.00.10. - Москва, 2004. - 186 с. : ил.
Оглавление диссертациикандидат химических наук Судьина, Анна Евгеньевна
Условные сокращения
Введение
Глава 1. Эндонуклеазы рестрикции как компоненты системы рестрикции-модификации
ДНК: классификация, структура и функции (Обзор литературы)
1.1. Общая характеристика систем рестрикции-модификации
1.2. Функции систем рестрикции-модификации
1.3. Номенклатура систем рестрикции-модификации
1.4. Классификация систем рестрикции-модификации
1.5. Организация систем рестрикции-модификации 1-го, П-го и Ш-го типов
1.5.1. Системы рестрикции-модификации 1-го типа
1.5.2. Системы рестрикции-модификации Ш-го типа
1.5.3. Системы рестрикции-модификации П-го типа
1.5.3.1. Классификация систем Р-М П-го типа
1.6. Эндонуклеазы рестрикции П-го типа
1.6.1. Структурная организация эндонуклеаз рестрикции ЭР П-го типа
1.6.2. Механизмы взаимодействия ЭР П-го типа с ДНК
1.6.2.1. Стадия связывания ДНК ферментом
1.6.2.2. Конформационные изменения ДНК и ЭР при образовании фермент-субстратного комплекса
1.6.2.3. Специфическое узнавание ДНК ЭР и формирование каталитически активного фермент-субстратного комплекса
1.6.3. Каталитические механизмы расщепления ДНК эндонуклеазами рестрикции
1.6.3.1. Переход от узнавания к катализу
1.6.3.2. Механизм гидролиза фосфодиэфирной связи
1.6.3.3. Структура активного центра ЭР П-го типа
1.6.3.4. Механизм катализа с участием одного иона металла
1.6.3.5. Механизм катализа с участием двух ионов металла
1.6.3.6. Механизм катализа с участием трех ионов металла
1.6.4. Применение эндонуклеаз рестрикции П-го типа в молекулярно-биологической практике
Глава 2. Эндонуклеазы рестрикции SsoII, PspGI и Mbol: изучение свойств и определение ДНК-связывающих доменов (Обсуждение результатов)
2.1. Сравнительный анализ первичной структуры ЭР SsoII, PspGI и Mbol
2.2. Разработка нового метода тестирования активности ЭР П-го типа
2.3. Изучение биохимических свойств ЭР SsoII, PspGI и Mbol
2.3.1. Определение параметров взаимодействия ЭР SsoII, PspGI и Mbol с ДНК
2.3.2. Влияние pH среды и концентрации NaCl на активность ЭР SsoII,
PspGI и Mbol
2.3.3. Влияние концентрации ионов Mg2+ на активность ЭР SsoII,
PspGI и Mbol
2.4. Определение функционально важных аминокислотных остатков ЭР SsoII, PspGI и Mbol, участвующих в узнавании и связывании ДНК-субстрата, методом сайт-направленного мутагенеза
2.5. Зондирование контактов в комплексах ЭР SsoII, PspGI и Mbol с ДНК-субстратами методом аффинной модификации
2.5.1. Использование ДНК-субстатов, содержащие фосфорилдисульфидную группу, для анализа взаимодействий в комплексе ЭР SsoII и PspGI с ДНК
2.5.2. Модификация ЭР PspGI под действием азидофенацилбромида
2.5.3. Анализ ДНК-белковых взаимодействий в комплексах ЭР SsoII и
Mbol с ДНК с помощью 2' -альдегидсодержащих субстратов
2.6. Построение филогенетического дерева для ЭР П-го типа и моделирование структуры активных центров ЭР SsoII и PspGI
2.6.1. Эволюционная взаимосвязь между различными ЭР П-го типа
2.6.2. Сравнение вторичной структуры ЭР SsoII, PspGI и Mbol и моделирование структуры активных центров ЭР SsoII и PspGI
Глава 3. Экспериментальная часть
3.1. Реактивы и материалы
3.2. Приборы и методы
3.3. Общие методики
3.3.1. Сравнительный анализ аминокислотных последовательностей
ЭР И-го типа
3.3.2. Синтез иммобилизованных олигонуклеотидов
3.3.3. Введение 32Р- и флуоресцентной меток в олигонуклеотиды
3.3.4. Проведение ферментативных реакций
3.3.5. Синтез протяженных ДНК-дуплексов
3.3.6. Выделение препаратов природной и мутантных форм ЭР SsoII,
PspGI и Mbol
3.3.7. Определение четвертичной структуры ЭР SsoII, PspGI и Mbol и стехиометрии их комплексов с ДНК методом гель-фильтрации
3.3.8. Исследование равновесного связывания ЭР SsoII, PspGI и Mbol с ДНК-дупл ексами
3.3.9. Определение константы скорости гидролиза ДНК-субстратов
ЭР SsoII, PspGI и Mbol
3.3.10. Исследование зависимости активности ЭР SsoII, PspGI и Mbol от рН среды
3.3.11. Исследование зависимости активности ЭР SsoII, PspGI и Mbol от концентрации NaCl и MgCh
3.3.12. Реакция ЭР SsoII и PspGI с ДНК-дуплексами, содержащими фосфорилдисульфидную группу
3.3.13. Фотохимическая модификация ДНК азидофенацильными производными ЭР PspGI
3.3.14. Ковалентное присоединение ЭР SsoII и Mbol к ДНК-дуплексам, содержащим 2' -альдегидную группу
3.3.15. Молекулярное моделирование активных центров ЭР SsoII и PspGI 158 Выводы 160 Список литературы