Функциональная экспрессия кДНК и иммуногистохимическое исследование гуанилатциклазы в сетчаткe быка Соловьева, Ольга Владимировна

brief description

Соловьева, Ольга Владимировна.
Функциональная экспрессия кДНК и иммуногистохимическое исследование гуанилатциклазы в сетчаткe быка : диссертация ... кандидата химических наук : 02.00.10. - Москва, 1999. - 122 с. : ил.
Оглавление диссертациикандидат химических наук Соловьева, Ольга Владимировна
ВВЕДЕНИЕ
1. РАЗЛИЧНЫЕ ТИПЫ ГУАНИЛАТЦИКЛАЗ: СТРУКТУРА И ФУНКЦИИ
(ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)
1.1. Введение
1.2. ЦИТОПЛАЗМАТИЧЕСКАЯ ФОРМА ГУАНИЛАТЦИКЛАЗЫ
1.2.1. Структура растворимых гуанилатциклаз
1.2.2. Роль гема - простетической группы гуанилатциклаз
1.2.3. Взаимосвязь состояния олигомеризации с ферментативной активностью белка
1.3. МЕМБРАННЫЕ ФОРМЫ ГУАНИЛАТЦИКЛАЗ
1.3.1. Полипептидрегулируемые гуанилатциклазы
1.3.1.1. GC - рецепторы натрийуретических пептидов
1.3.1.2. GC, активируемая бактериальными термостабильными энтеротоксинами
1.3.1.3. GC, активируемая пептидами из икры морского ежа
1.3.2. Гуанилатциклазы, стимулируемые кальцием
1.3.2.1. Гуанилатциклазы фоторецепторных клеток
1.3.2.2. Белки - активаторы гуанилатциклаз фоторецепторных клеток
1.3.2.2.1. Гуанилатциклаз-активирующие белки (GCAP)
1.3.2.2.2. Кальций зависимый гуанилатциклаз-активирующий белок
1.3.2.3. GC из Tetrahymena и Paramecium
1.3.3. GC, регулируемые G- белками
1.3.3.1. Мускарин-регулируемая GC
1.4. СТРУКТУРА МЕМБРАННОЙ ФОРМЫ ГУАНИЛАТЦИКЛАЗЫ
1.4.1. Зависимость каталитической активности мембранных форм гуанилатциклаз от состояния олигомеризации
1.4.2. Регуляция каталитической активности мембранных форм гуанилатциклаз
1.4.2.1. Функционирование протеинкиназоподобного домена мембранных гуанилатциклаз
1.4.3. Фосфорилирование мембранных форм гуанилатциклаз
2. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
2.1. Введение
2.2. Экспрессия фрагмента кДНК гена гуанилатциклазы В в клетках Escherichia coli
2.2.1. Получение экспрессирующих конструкций, содержащих фрагмент к ДНК гена гуанилатциклазы В
2.2.2. Экспрессия фрагмента кДНК гена гуанилатциклазы В в клетках Е. соИ, идентификация и выделение рекомбинантного продукта
2.2.3. Рефолдинг солюбилизированного рекомбинантного белка гуанилатциклазы В
2.2.4. Определение ферментативной активности рекомбинантного белка
2.2.5. Аналитическая гель-фильтрация рекомбинантного белка
2.3. Экспрессия фрагментов кДНК гена гуанилатциклазы В в эукариотической системе РгсЫа ро81ош
2.3.1. Создание конструкций на основе челночного вектора рН1Ь-81, экспрессирующих ОС-В
2.3.2. Селекция и отбор трансформантов
2.3.3. Анализ рекомбинантных клонов РгсЫараз1ош
2.3.4. Отбор мультикопийных клонов
2.3.5. Выявление мРНК рекомбинантной гуанилатциклазы В
2.3.6. Экспрессия фрагментов кДНК гена гуанилатциклазы В в дрожжах РюЫа рах^пь, выделение и очистка рекомбинантных белков
2.4. Свойства рекомбинантных белков ОС-Вр и ОС-В§
2.4.1. Определение гуанилатциклазной активности рекомбинантных белков
2.4.2. Гуанилатциклаза В является представителем семейства Бег/ТИг протеинкиназ
2.5. Локализация гуанилатциклазы В в клетках сетчатки глаза быка
2.5.1. Получение поликлональных антител к гуанилатциклазе В
2.5.2. Иммуногистохимическое исследование срезов сетчатки глаза быка
3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 73 3.1. Материалы
3.1.1. Реактивы
3.1.2. Ферменты
3.1.3. Штаммы и плазмидные векторы
3.1.4. Микробиологические среды и буферы
3.1.4.1. Микробиологические среды
3.1.4.2. Буферные растворы для ферментов модификации ДНК
3.1.5. Другие растворы
3.1.6. Фотографические растворы
3.2. Методы
3.2.1. Приготовление агарозного геля
3.2.2. Выделение плазмидной ДНК клетокЕ. coli
3.2.3. Рестрикция фрагментов ДНК
3.2.4. Получение компетентных клетокЕ. coli
3.2.5. Трансформация компетентных клетокЕ. coli
3.2.6. Определение нуклеотидной последовательности кДНК секвенированием по методу Сэнгера
3.2.6.1. Приготовление препаратов плазмид-матриц для секвенирования
3.2.6.2. Реакция секвенирования
3.2.7. Электрофорез белков
3.2.7.1. Приготовление образца
3.2.7.2. Условия проведения электрофореза
3.2.8. Электроблотинг белков
3.2.9. Клонирование кДНК гуанилатциклазы В и определение ее нуклеотидной последовательности
3.2.10. Экспрессия фрагмента кДНК гуанилатциклазы В в клетках Е. coli
3.2.11. Очистка рекомбинантного белка
3.2.12. Аналитическая гель-фильтрация
3.2.13. Выделение тотальной РНК из сетчатки глаза быка
3.2.13.1. Синтез первой цепи к ДНК
3.2.14. Приготовление компетентных клеток Р. pastoris
3.2.15. Трансформация клеток Р. pastoris методом электропорации
3.2.16. Выделение геномной ДНК дрожжей Р. pastoris
3.2.17. Анализ рекомбинантных клонов Р. pastoris методом ПЦР
3.2.18. Выделение тотальной РНК дрожжей Р. pastoris
3.2.19. Синтез первой цепи кДНК
3.2.19.1. Постановка полимеразной цепной реакции на гибридной матрице мРНК/ДНК
3.2.20. Экспрессия фрагмента кДНК гуанилатциклазы В в дрожжах Р. pastoris, очистка рекомбинантного белка
3.2.21. Измерение ферментативной активности
3.2.22. Реакция фосфорилирования
3.2.23. Обработка мембраны
3.2.24. Фосфоаминокислотный анализ
3.3. Иммуноферментный анализ
3.3.1. Получение коньюгата для иммунизации животных
3.3.2. Получение поликлональных антител к гуанилатциклазе В
3.3.3. Анализ тканевых срезов
4. ВЫВОДЫ
5. СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
6. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ