Функциональный анализ мутаций в гене стероид 21-гидроксилазы человека у больных с адреногенитальным синдромом Грищук, Юлия Владимировна

brief description

Грищук,ЮлияВладимировна.Функциональныйанализмутацийвгенестероид21-гидроксилазычеловекаубольныхсадреногенитальнымсиндромом: диссертация ... кандидата биологических наук : 03.00.03. - Москва, 2006. - 136 с. : ил.больше
Цитаты из текста:

стр. 1
61:07-3/375 Российская академия наук Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта На нравах руконисиГРИЩУКЮлияВладимировнаФУНКЦИОНАЛЬНЫЙАНАЛИЗМУТАЦИЙВГЕНЕСТЕРОИД21-ГИДРОКСИЛАЗЫЧЕЛОВЕКАУБОЛЬНЫХСАДРЕНОГЕНИТАЛЬНЫМСИНДРОМОМ03.00.03 - молекулярная биология Диссертация на соискание

стр. 2
36 1.5. Системы гетерологичной экспрессиигенов, используемые для получения рекомбинантнойстероид21 -гидроксилазычеловека1.6.Стероид21-гидроксилазакак представитель надсемейства цитохромов Р450 1.6.1. Состав ифункциональноезначение надсемейства цитохромов Р450 1.6.2. Механизм монооксигеназной

стр. 30
о структурных ифункциональныхособенностяхстероид-21гидроксилазы и механизмах возникновениямутацийвгенеCYP21A2. 1.4.4. Возникновениемутацийde novo. В процессе молекулярно-генетического дефицитомстероид-21-гидроксилазыанализау пациентов с повреждениягенавыявляются CYP21A2, возникшие de novo,

Оглавление диссертациикандидат биологических наук Грищук, Юлия Владимировна
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.
ВВЕДЕНИЕ.
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.
1.1. Биосинтез стероидных гормонов.
1.1.1. Синтез стероидных гормонов в коре надпочечников человека -общие стадии.
1.1.2. Синтез минералокортикоидов.
1.1.3. Синтез глюкокортикоидов.
1.1.4. Синтез половых гормонов.
1.2. Наследственные нарушения биосинтеза стероидов.
1.2.1. Адреногенитальный синдром.
1.2.2. Формы недостаточности 21-гидроксилазы.
1.2.3. Частота недостаточности 21-гидроксилазы.
1.3. Особенности структуры и расположения гена CYP21A2.
1.3.1 Область генов комплекса гистосовместимости III класса.
1.3.2. Структура RCCX-модуля.
1.3.3 Структура гена CYP21A2 и псевдогена CYP21AIP.
1.4. Молекулярно-генетические механизмы возникновения и методы выявления мутаций в гене CYP21A2.
1.4.1. Крупные делеции гена по механизму неравного кроссинговера.
1.4.2. Небольшие генные конверсии.
1.4.3 Мутации, не связанные с псевдогеном.
1.4.4. Возникновение мутаций de novo.
1.4.5. Методы выявления мутаций в гене CYP21A2.
1.4.6. Молекулярно-генетический анализ гена CYP21A2 в российской популяции.
1.4.7. Корреляция между генотипом и клинической формой заболевания при дефиците 21-гидроксилазы.
1.5. Системы гетерологичной экспрессии генов, используемые для получения рекомбинантной стероид 21-гидроксилазы человека.
1.6. Стероид 21-гидроксилаза как представитель надсемейства цитохромов Р450.
1.6.1. Состав и функциональное значение надсемейства цитохромов Р450.
1.6.2. Механизм монооксигеназной реакции.
1.6.3. Пространственная организация молекул надсемейства цитохромов Р450.
2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.
2.1 Пациенты и молекулярно-генетический анализ мутаций.
2.2. Используемые клеточные линии и бактериальные штаммы.
2.3. Создание генно-инженерных конструкций и сайт-специфичный мутагенез.
2.4. Культивирование и трансфекция клеток COS-7.
2.5. Анализ каталитической активности в клетках COS-7.
2.6. Получение рекомбинантных бакуловирусных векторов.
2.7. Получение рекомбинантных бакмид.
2.8. Трансфекция клеток насекомых и получение рекомбинантных бакуловирусов.
2.9. Определение вирусного титра.
2.10. Экспрессия в клетках насекомых Sf9 и Я/5.
2.11. Получение микросомных фракций.
2.12. Анализ каталитической активности в микросомной фракции Я/5.
2.13. Измерение концентрации белка.
2.14. ДСН-ПААГ электрофорез.
2.15. Вестерн-блот-анализ.
2.16. Иммунофлуоресценция.
2.17. Получение компетентных клеток E.coli и трансформация.
2.18. Анализ клонов методом ПЦР.
2.19. Выделение плазмидной ДНК.
2.20. Расщепление ДНК эндонуклеазами рестрикции.
2.21. Фракционирование и очистка фрагментов ДНК в агарозном геле.
2.22. Лигирование.
2.23. Моделирование трехмерной структуры.
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.
3.1. Введение мутаций в заданные положения нуклеотидной последовательности кДНК гена CYP21A2.
3.2. Экспрессия и функциональный анализ CYP21A2 дикого типа и мутантных вариантов в клетках COS-7.
3.3. Влияние мутаций на локализацию CYP21A2 в клетках COS-7.
3.4. Экспрессия кДНК CYP21A2 и мутантного варианта C169R в клетках насекомых с использованием бакуловирусной системы.
3.5. Ферментативная активность CYP21A2 и CYP21A2-C169R в препаратах микросом из клеток Hi5.
3.6. Анализ модели трехмерной структуры.