Ингибирование неорганической пирофосфатазы из дрожжей монеэфирами фосфорной кислоты различного строения Свято, Ирина Евгеньевна

brief description

Свято, Ирина Евгеньевна.
Ингибирование неорганической пирофосфатазы из дрожжей монеэфирами фосфорной кислоты различного строения : диссертация ... кандидата химических наук : 02.00.10. - Москва, 1984. - 157 с. : ил.
Оглавление диссертациикандидат химических наук Свято, Ирина Евгеньевна
ВВЕДЕНИЕ
Глава I. ИССЛЕДОВАНИЕ МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ ФЕРМЕНТОВ И
СТРОЕНИЯ ИХ АКТИВНОГО ЦЕНТРА С ПОМОЩЬЮ МЕТОДА
АФФИННОЙ МОДИФИКАЦИИ (Обзор литературы)
1. Оксиредуктазы.
2. Трансферазы.
3. Гидролазы.
4. Лиазы.
5. Изомеразы.
6. Лигазы.
Глава П. ОСОБЕННОСТИ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ НЕОРГАНИЧЕСКОЙ ПИРО-ФОСФАТАЗЫ ИЗ ДРОЖЖЕЙ С МОНОЭФИРАМИ ФОСФОРНОЙ КИСЛОТЫ РАЗЛИЧНОГО СТРОЕНИЯ (Обсуждение результатов) . . .4V.
1. Центры связывания аффинных ингибиторов неорганической пирофосфатазы.
2. Кооперативные взаимодействия субъединиц в неорганической пирофосфатазе.
3. Роль четвертичной структуры пирофосфатазы в аффинной модификации.
4. Расположение аффинных ингибиторов в активном центре неорганической пирофосфатазы.
Глава Ш. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.
1. Исходные вещества.
2. Методы исследования. III
2.1. Хроматография. III
2.2. Обнаружение веществ на хроматограммах.III
2.3. Определение радиоактивности.III
2.4. Количественное определение неорганического фосфата.
2.5. Количественное определение содержания фосфора в модифицированном белке.
2.6. Определение концентрации белка. а) Определение концентрации нативного фермента. . . . ИЗ б) Определение концентрации иммобилизованного фермента.ИЗ
2.7. Определение ферментативной активности пирофосфатазы.ИЗ
3. Исследование реакции неорганической пирофосфатазы с моноэфирами фосфорной кислоты.
3.1. Инактивация пирофосфатазы под действием метил-фосфата, фосфогликолевой кислоты, N-ацетилфос-фосерина, О-фосфоэтаноламина, 0-фосфопропанол~ амина и метилового эфира О-фосфосерина.
3.2. Реакция пирофосфатазы с монозфирами фосфорной кислоты в присутствии субстрата ~ неорганического пирофосфата.
3.3. Расчет констант скорости и констант ингибирования.
3.4. Модификация неорганической пирофосфатазы моноэфирами фосфорной кислоты.
3.5. Зависимость скорости инактивации фермента от концентрации моноэфиров фосфорной кислоты.
3.6. Влияние ингибиторов на кинетику гидролиза пирофосфата магния.
3.7. Получение фермент-субстратного комплекса, стабилизированного фторидом.
3.8. Влияние моноэфиров фосфорной кислоты на реактивацию фермент-субстратного соединения пирофосфатом натрия.
3.9. Влияние моноэфиров фосфорной кислоты на реактивацию фермент-субстратного соединения триполифосфатом натрия.
ЗЛО. Получение пирофосфатазы, модифицированной на 50$ метилфосфатом, Ы-ацетилфосфосерином, О-фосфопропаноламином или О-фосфоэтаноламином. . 118 3.II. Изучение кинетики реактивации фермента, модифицированного метилфосфатом, Ы-ацетилфос-фосерином или О-фосфопропаноламином, под действием пирофосфата натрия, триполифосфата натрия и хлористого магния.
4. Кооперативные взаимодействия субъединиц в неорганической пирофосфатазе.
4.1. Получение пирофосфатазы с одной модифицированной субъединицей.
4.2. Протеолиз субтилизином нативной и модифицированной пирофосфатазы.
4.3. Протеолиз субтилизином неорганической пирофосфатазы, модифицированной Н-ацетилфосфосерином, в присутствии имидодифосфата натрия и
5. Исследование значения четвертичной структуры пирофосфатазы для протекания аффинного ингибирования.
5.1. Иммобилизация пирофосфатазы.
5.2. Получение иммобилизованной субъединицы неорганической пирофосфатазы и реконструкция димерной формы фермента.
5.3. Исследование влияния монофосфатов на иммобилизованные производные пирофосфатазы во времени.
5.4. Влияние моноэфиров фосфорной кислоты на кинетику гидролиза пирофосфата магния иммобилизованными производными фермента.
6. Выделение пептида, содержащего аминокислоту, модифицированную метилфосфатом.
6.1. Последовательная модификация пирофосфатазы метилфосфатом и [^Н]-Ы-метилгидроксиламином.
6.2. Выделение и характеристика пептида, содержащего аминокислоту, модифицированную метилфосфатом.
6.3. Определение Ы-концевой аминокислоты методом дансилирования /208/.
6.4. Определение аминокислотного состава меченого пептида.
ВЫВОДЫ.