Исследование резонансного переноса энергии биолюминесценции в гибридных белках и их комплексах Гороховатский, Андрей Юрьевич

brief description

Гороховатский, Андрей Юрьевич.
Исследование резонансного переноса энергии биолюминесценции в гибридных белках и их комплексах : диссертация ... кандидата химических наук : 02.00.10. - Пущино, 2005. - 133 с. : ил.
Оглавление диссертациикандидат химических наук Гороховатский, Андрей Юрьевич
Содержание.
Список сокращений.
I. ВВЕДЕНИЕ.
II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ: РЕЗОНАНСНЫЙ ПЕРЕНОС ЭНЕРГИИ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИХ МАКРОМОЛЕКУЛ.
II. 1. Резонансный перенос энергии флуоресценции.
II.1.1. Основные понятия и термины.
II. 1.2. Ограничения FRET.
11.2. Методы детектирования резонансного переноса энергии.
11.2.1. Равновесная спектроскопия.
11.2.2. Измерения времени жизни возбужденного состояния.
И.2.2.1. Импульсный метод.
II.2.2.2. Фазово-модуляционный метод.
11.2.3. FRET-микроскопия.
11.2.4. Измерения на уровне одиночных донор-акцепторных пар.
11.3. Синтетические хромофоры, используемые в приложениях резонансного переноса энергии.
11.3.1. Органические флуоресцентные метки.
11.3.2. Люминесцентные хелаты лантаноидов.
11.3.3. Полупроводниковые нанокристаллы.
11.4. Зеленый флуоресцентный белок - генетически-кодируемый флуорофор в приложениях FRET.
11.4.1. Спектральные свойства GFP.
11.4.2. Варианты зеленого флуоресцентного белка.
11.4.3. GFP-подобные флуоресцентные белки из других организмов.
11.4.4. Использование FRET между вариантами GFP.
II.4.4.1. Внутримолекулярные FRET-индикаторы.
И.4.4.2. Межмолекулярные FRET-индикаторы.
11.5. Резонансный перенос энергии биолюминесценции.
11.5.1. Люциферазы Renilla reniformis и Aequorea victoria.
11.5.2. Механизм переноса энергии.
11.5.3. Использование BRET.
III. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.
III. 1. Материалы и реактивы.
111.2. Генетические конструкции.
111.3. Экспрессия генетических конструкций в клетках Е. coli и очистка рекомбинантных белков.
111.3.1. Акворин, обелин и гибриды GFP/EGFP-Aeq/Ob.
111.3.2. GFP и EGFP.
111.3.3. Гибрид EGFP-RLuc.
111.3.4. Гибрид BCCP-EGFP.
111.3.5. Гибрид SAV-Aeq.
111.3.6. Активация апо-белков целентеразином.
111.3.7. Определение концентрации белков.
111.4. Спектральные методы.
111.4.1. Спектры поглощения и кругового дихроизма.
111.4.2. Спектры флуоресценции.
111.4.3. Спектры биолюминесценции.
111.4.4. Биолюминесцентная активность Са2+-активируемых фотобелков и их гибридов.
111.4.5. Расчет интеграла спектрального перекрывания и Ro.
111.4.6. Определение эффективности BRET.
111.4.6.1. Анализ спектров.
111.4.6.2. Измерение сигнала BRET в двулучевом люминометре.
111.4.7. Кинетические измерения методом остановленного потока.
111.5. Электрофоретические методы.
111.5.1. ДСН-ПААГ электрофорез.
111.5.2. Перенос белков на нитроцеллюлозную мембрану.
111.6. Иммунологические методы.
111.6.1. Выделение IgG кролика.
111.6.2. Получение поликлональных антител к GFP.
111.6.3. Получение поликлональных антител к акворину.
111.6.4. Обработка нитроцеллюлозных мембран.
III.7. Другие методы.
111.7.1. Трипсинолиз гибридного белка GFP-19-Aeq.
111.7.2. Определение активности каспазы-3 in vitro.
111.7.3. Калибровка сигнала BRET.
111.7.4. Определение Kcat/KM.
111.7.5. Определение активности каспазы-3 в клеточных лизатах.
111.7.6. Биотинилирование EGFP и IgG кролика.
111.7.7. Анализ биотина.
IV. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.
IV. 1. Экспрессия генетических конструкций и очистка гибридных белков.
IV.2. Спектральные характеристики гибридных белков и эффективность внутримолекулярного BRET.
IV.3. Исследование механизмов внутримолекулярного BRET в акворинсодержащих гибридных белках.
IV.4. Характеристика биолюминесцентных субстратов для определения активности каспазы-3 методом внутримолекулярного BRET.
IV.5. Тестирование белок-белковых взаимодействий методом межмолекулярного BRET.
V. ВЫВОДЫ.
VI. БЛАГОДАРНОСТИ.