Изучение свойств растительной триптофанрацемазы и ее роли при прорастании и осмотическом стрессе Копытина, Татьяна Васильевна

brief description

Копытина,ТатьянаВасильевна.Изучениесвойстврастительнойтриптофанрацемазыиееролиприпрорастаниииосмотическомстрессе: диссертация ... кандидата биологических наук : 03.00.12. - Иркутск, 2001. - 152 с. : ил.больше
Цитаты из текста:

стр. 1
РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК СИБИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ СИБИРСКИЙ ИНСТИТУТ ФИЗИОЛОГИИ И БИОХИМИИ РАСТЕНИЙ На правах рукописи ' УДК 581. 142:581. 197.7.КопытинаТатьянаВасильевнаИЗУЧЕНИЕСВОЙСТВРАСТИТЕЛЬНОЙТРИПТОФАНРАЦЕМАЗЫИ ЕЕРОЛИПРИПРОРАСТАНИИИОСМОТИЧЕСКОМСТРЕССЕ03.00.12. - физиолргйя и бЙ0х;имия

стр. 53
D триптофана и малонил-О-триптофанаприосмотическомстрессеи завядании Вопрос об изменениях врастительномметаболизме, возникающихприосмотическомстрессеи завядании, является основным дляизученияпроцессов адаптации. Опубликован развернутый обзор Hanson и Hitz (1982), объединяющий данные по метаболическому

стр. 134
способных выживать в экстремальных климатических условиях. 135 ВЫВОДЫ 1. Впервые изучены активность и другие физиолого-биохимическиесвойстварастительнойтриптофанрацемазыприпрорастаниииосмотическомстрессе, установлена еерольв индольном метаболизме и ростовых процессах. 2. В период гетеротрофного роста проростков пшеницы активизироваласьтриптофанрацемаза, превраш;ающая преимуш[ественно ЬТри в ОТри. С возрастом проростка...

Оглавление диссертациикандидат биологических наук Копытина, Татьяна Васильевна
ВВЕДЕНИЕ.
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.
1.1 Зеркальная изомерия в природе.
1.1.1 Стереоконфигурация природных и синтетических органических веществ
1.1.2 Природные О-аминокислоты. Встречаемость и предполагаемая физиологическая роль.
1.2. Биохимическая характеристика рацемаз.
1.2.1. Рацемазы - пиридоксальфосфатзависимые ферменты.
1.2.2. Структура, свойства и особенности функционирования активных центров в зависимости от осмотичности среды.
1.3 Общие сведения о рацемазах.
1.3.1. Жизненно важная роль рацемаз у бактерий.
1.3.2 Сведения о рацемизации аминокислот в клетках животных и человека.
1.3.3. Свидетельства функционирования рацемаз в растительных клетках.
1.4. Участие триптофанрацемазы в биосинтезе ИУК у растений в различных физиологических состояниях.
1.4.1. Присутствие В-аминокислот и Б-триптофана, а также конъюгатов в семенах и проростках как свидетельство рацемизации.
1.4.2. Адаптации растений к осмотическому стрессу. Индукция образования Б-триптофана и малонил-Б-триптофана при осмотическом стрессе и завядании.
1.4.3. Снабжение субстратом Б-триптофанаминотрансферазы.
1.5. Системы переноса растительных генов.
1.5.1. Экспрессирующие фаговые и бактериальные векторы.
2. ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЙ.
3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.
3.1 .Объекты исследований.
3.1.1. Растительные объекты исследований.
3.1.2. Бактериальные штаммы для клонирования в фаге A,gtl 1.
3.1.3. Условия выращивания растительного материала.
3.1.4. Условия культивирования бактериальных штаммов.
3.2. Получение и фракционирование ферментного препарата триптофанрацемазы.
3.2.1. Выделение триптофанрацемазы.
3.2.2. Хроматография на ДЭАЭ-целлюлозе.
3.2.3. Хроматография на D-триптофан-агарозе.
3.2.4. Определение активности триптофанрацемазы.
3.3. Определение кинетических параметров рацемазы.
3.4. Определение молекулярной массы триптофанрацемазы.
3.4.1. Электрофоретическое разделение в ПААГ.
3.4.2. Гельфильтрация.
3.5.Получение антисыворотки на триптофанрацемазу.
3.5.1. Иммунодиффузия в геле.
3.6. Скрининг библиотеки кДНК с антителами на триптофанрацемазу.
3.6.1. Получение фаговых бляшек на бактериальном газоне.
3.6.2. Проведение гибридизационного скрининга.
3.7. Анализ рекомбинантных клонов, несущих кДНК пшеницы.
3.7.1. Выращивание фаговых векторов.
3.7.2. Выделение фаговой ДНК.
3.7.3. Выделение плазмидной ДНК.
3.7.4. Гидролиз ДНК рестриктазами.
3.7.6. Выделение триптофанрацемазы, экспрессируемой в лизогенах E.coli Y1089.
3.8. Статистическая обработка данных.
3.11. Используемые реактивы и материалы.
4. РЕЗУЛЬТАТЫ.
4.1. Изучение активности триптофанрацемазы в динамике роста проростков пшеницы.
4.1.1. Влияние повышенной осмотической концентрации на активность триптофанрацемазы из пшеницы и томатов.
4.1.3. Получение синтетических 1Ч-малонил-Ь-триптофана и И-малонил-О-триптофана и изучение их способности к рацемизации.
4.1.4. Активность триптофанрацемазы в различных сортах и гибридах пшеницы
4.2. Оптимизация условий выделения и фракционирование триптофанрацемазы
4.2.1. Влияние ингибиторов протеаз и глицерина на активность триптофанрацемазы.
4.2.2. Влияние ПЛФ на активность триптофанрацемазы.
4.2.3. Влияние фракционирования с помощью ионно-обменной и аффинной хроматографии на активность триптофанрацемазы.
4.3. Активность триптофанрацемазы из проростков томатов.
4.4. Определение субстратной специфичности триптофанрацемазы.
4.4. 1. Сравнительный аминокислотный состав проростков пшеницы.
4.4.2. Определение кинетических свойств триптофанрацемазы.
4.5. Определение молекулярной массы триптофанрацемазы.
4.5.1. Электрофоретическое разделение в ПААГ.
4.5.3. Гельфильтрация на Молселекте Г-75.
4.4. Иммунологический анализ антител к триптофанрацемазе из проростков пшеницы, полученных в сыворотке кролика.
4.4.1. Оценка иммунологического сродства антител к цитозольной и этиопластной триптофанрацемазе.
4.7. Анализ рекомбинантных клонов фага выявивших иммунопозитивную реакцию с антителами на триптофанрацемазу.
4.7.1. Рестрикционный анализ ДНК из рекомбинантов А^Н 1.
4.7.2. ПЦр-амплификация кДНК пшеницы в фаге Х&11.
4.7.3. Лизогенизация клетокЕ.соИУ1089.
4.7.4. ПЦР -амплификация кДНК пшеницы в геномной ДНК из лизогенов E.coli
Y1089.
4.7.5. Тест на осмотолерантность лизогенизированных клеток E.coli Y1089.
4.7.6. Анализ активности триптофанрацемазы, экспрессируемой в E.coli Y
5. ОБСУЖДЕНИЕ.