Клонирование генов вне клетки Саматов, Тимур Рустэмович

brief description

Саматов,ТимурРустэмович.Клонированиегеноввнеклетки: диссертация ... кандидата биологических наук : 03.00.03. - Москва, 2006. - 114 с. : ил.больше
Цитаты из текста:

стр. 1
61:06-3/936 РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ БЕЛКА На правах рукописиСАМАТОВТимурРустэмовичКлонированиегеноввнеклетки03.00.03 - Молекулярная биология

стр. 5
молекулярноеклонированиегенов4.1.1. Преимущества бесклеточногоклонирования4.1.2.Генлюциферазы: от светляка до индивидуальных молекулярных клонов 4.2. Экспрессия

стр. 5
4.3. Перспективы развития методаклонированиягеноввнеклетки4.3.1. Методы детекции молекулярных колоний 4.3.2. Изотермические системы размножениягенов4.3.3. Использование бесклеточной системы экспрессии, собранной из очищенных компонентов ВЫВОДЫ Цитированная литература - 99 • -101 • - 102 • - 90 •

Оглавление диссертациикандидат биологических наук Саматов, Тимур Рустэмович
Использованные сокращения.- б
• ВВЕДЕНИЕ.
1. Обзор литературы.
1.1. Подходы in vivo (методы, использующие клетки).
1.1.1. Фаговый дисплей.
1.1.2. Дисплей на поверхности клеток.
Ф 1.1.3. «Пептиды на плазмидах».
1.1.4. Преимущества и недостатки дисплеев in vivo.
1.2. Подходы in vitro (бесклеточные методы).
1.2.1. Дисплеи, где белок связан с РНК.
1.2.1.1. Нековалентная связь мРНК с белком.
1.2.1.2. Ковалентная связь мРНК с белком.
1.2.2. Дисплеи, где белок связан с ДНК.
1.2.3. In vitro компартментализация.
1.2.3.1. Простая эмульсия.
1.2.3.2. Двойная эмульсия.
1.2.3.3. Особенности метода in vitro компартментализации.
1.2.4. Преимущества и недостатки дисплеев in vitro.
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
2.1. Штаммы E.coli и плазмиды.
2.1.1. Штаммы E.coli.
2.1.2. Плазмиды.
2.2. Микробиологические среды.ь 2.3. Трансформация клеток E.coli.
2.4. Выделение и очистка плазмидной ДНК.
2.4.1. Грубое выделение плазмидной ДНК.
2.4.2. Очистка плазмидной ДНК при помощи кипячения в присутствии
Мд2+ и Трис-HCI (рН 9,0).
2.4.3. Фенольная депротеинизация ДНК.
2.5. Выделение РНК из светляка Luciola mingrelica.
2.6. Электрофорез нуклеиновых кислот и белков.
2.6.1. Электрофорез ДНК и РНК в агарозных гелях.ф 2.6.2. Электрофорез ДНК и РНК в полиакриламидных гелях.
2.6.2.1. В денатурирующих условиях.
2.6.2.2. В неденатурирующих условиях.
2.6.3. Электрофорез белков в присутствии додецилсульфата натрия.
2.7. Саузерн-блот анализ.
2.7.1. Перенос ДНК из геля на мембрану.
2.7.2. Гибридизация с меченым зондом.
2.8. Определение концентрации белка.
2.9. Выделение и очистка термостабильных ДНК-зависимых ДНК-полимераз.
2.9.1. Получение препарата (Н1з)б-Риго-полимеразы.
2.9.2. Получение препарата (Ыэ^-Гад-полимеразы.
2.10. Ферментативные реакции.
2.10.1. Рестрикция.
2.10.2. Обратная транскрипция (синтез кДНК).
2.10.3. Транскрипция.
2.10.4. Полимеразная цепная реакция (ПЦР).
2.11. Получение экстракта зародышей пшеницы.
2.11.1. Обработка зародышей пшеницы перед разрушением.
2.11.2. Разрушение зародышей пшеницы.
2.11.3. Гель-фильтрация экстракта зародышей пшеницы.
2.12. Совмещенная транскрипция-трансляция in vitro.
2.12.1. Транскрипция-трансляция в системе на основе экстракта S30 E.coli.
2.12.2. Транскрипция-трансляция в системе на основе экстракта зародышей пшеницы.
2.13. Метод молекулярных колоний.
2.13.1. Подготовка полиакриламидных гелей.
2.13.2. Полимеразная цепная реакция в геле.
2.13.3. Транскрипция в геле.
2.13.4. Совмещенная транскрипция-трансляция в геле.
2.13.5. Обнаружение колоний ДНК и РНК.
2.13.5.1. Перенос нуклеиновых кислот из геля на мембрану.
2.13.5.2. Гибридизация с меченым зондом.
2.13.6. Детекция белков, синтезированных в геле.
2.13.6.1. Детекция по включению радиоактивной метки.
2.13.6.2. Детекция флуоресценции GFP.
3. РЕЗУЛЬТАТЫ.
3.1. Цели и экспериментальные задачи.
3.2. Разработка ПЦР-версии метода молекулярных колоний.
3.2.1. Выбор иммобилизованной среды.
3.2.2. Смесь термостабильных ДНК-полимераз.
3.2.3. Эффективность переноса днк из геля на мембрану.
3.2.4. Размножение генов обелина и GFP в виде молекулярных колоний
3.3. Клонирование in vitro «ДНК люциферазы.
3.3.1. Синтез и размножение кДНК люциферазы в жидкой среде и в геле
3.3.2. Отбор и размножение молекулярных клонов.
3.4. Транскрипция в молекулярных колониях.
3.5. Синтез белка в молекулярных колониях.
3.5.1. Выбор системы транскрипции-трансляции.
3.5.2. Транскрипция-трансляция в геле.
3.5.3. Проблема несовместимости условий ПЦР и транскрипции-трансляции и ее решение.
3.5.4. Экспрессия гена GFP в молекулярных колониях.
4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.
4.1. Истинно молекулярное клонирование генов.
4.1.1. Преимущества бесклеточного клонирования.
4.1.2. Ген люциферазы: от светляка до индивидуальных молекулярных клонов.
4.2. Экспрессия генов в молекулярных колониях.
4.2.1. Новая разновидность генетического дисплея.
4.2.2. Универсальный способ смены реакционной среды в геле.
4.3. Перспективы развития метода клонирования генов вне клетки.
4.3.1. Методы детекции молекулярных колоний.
4.3.2. Изотермические системы размножения генов.
4.3.3. Использование бесклеточной системы экспрессии, собранной из очищенных компонентов.
ВЫВОДЫ.