Роль белковых факторов и РНК-белковых взаимодействий в импорте тРНК в митохондрии дрожжей Брандина, Ирина Львовна

brief description

Брандина,ИринаЛьвовна.РольбелковыхфакторовиРНК-белковыхвзаимодействийвимпортетРНКвмитохондриидрожжей: диссертация ... кандидата биологических наук : 03.00.03. - Москва, 2005. - 197 с. : ил.больше
Цитаты из текста:

стр. 1
'. 05'-d/^5'<^i Биологический факультет На правах рукописи УДК 547.963.32.02 МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В. ЛОМОНОСОВАБРАНДИНАИринаЛьвовнаРОЛЬБЕЛКОВЫХФАКТОРОВИРНК-БЕЛКОВЫХВЗАИМОДЕЙСТВИЙВИМПОРТЕтРИК ВМИТОХОНДРИИДРОЖЖЕЙ03.00.03 - молекулярная биология ДИССЕРТАЦИЯ На соискание

стр. 2
п и с о к СОКРАЩЕНИЙ 5 ВВЕДЕНИЕ 7 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 9 1.ИмпорттРНКвмитохондрии9 1.1.ИмпорттРНКвмитохондриипростейших 10 1.1.1.ИмпорттРНКвмитохондрииTetrahymena 10 1.1.2.ИмпорттРНКвмитохондриитрипаносоматид 12 1.1.2.а. Отряд Kinetoplastidae 12 1.1.2.6. Отряд Leishmania 14 1.1.3. Другие представители простейших 19 1. 2.ИмпорттРНКвмитохондриидрожжей19 1.3....

Оглавление диссертациикандидат биологических наук Брандина, Ирина Львовна
ВВЕДЕНИЕ.
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.
1. Импорт тРНК в митохондрии.
1.1. Импорт тРНК в митохондрии простейших.
1.1.1. Импорт тРНК в митохондрии Tetrahymena.
1.1.2. Импорт тРНК в митохондрии трипаносоматид.
1.1.2.а. Отряд Kinetoplastidae.
1.1.2.6. Отряд Leishmania.
1.1.3. Другие представители простейших.
1. 2. Импорт тРНК в митохондрии дрожжей.
1.3. Импорт тРНК в митохондрии растений.
1.4. Импорт тРНК в митохондрии животных.
2. Убиквитин-протеасомная система деградации белков.
2.1.Введени е.
2.2. Функции УПС в клетке.
2.3. Убиквитинилирующая система в S. cerevisiae.
2.4. 26S протеасома: строение и функционирование.
2.4.1.20S субчастица, или каталитическое ядро.
2.4.2. 19S регуляторная субчастица.
2.5.Где локализованы протеасомы в клетке?.
2.6. Узнавание полиубиквитиновых цепей.
2.6.7. Протеасомные субъединицы, узнающие полиубиквитиновые цепи.
2.6.2. ЕЗ и Е4 ферменты в направлении субстратов к протеасоме.
2.6.3. Доставка субстратов к протеасоме посредством Cdc48 и его кофакторовАЪ
2.6.4. Шапероны и их кофакторы в деградации белков.
2.7. UFD путь. "' '. DOA1 как компонент UFD-nymu.
2.8. Непротеолитическая роль убиквитина и убиквитин-связывающих белков в клетке
2.8.1. Образование моноубиквитинилированных белков.
2.8.2. Связывание моноубиквитинилированных белков с различными убиквитин-связывающими доменами.
2.8.3. Альтернативные функции убиквитина.
A. Убиквитин изменяет локализацию белков.
Б. Убиквитин влияет на функцию белков.
B. Убиквитин регулирует белок-белковые взаимодействия.
Г. Убиквитин влияет на наследование и морфологию митохондрий.
Д. Убиквитин участвует в митохондриальной локализации белков.
2.9. Индукция УПС и каскадов протеинкиназ в ответ на тепловой шок.
3. Енолаза - гликолитический фермент.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.
Материалы.
Реактивы.
Коммерческие наборы.
Антитела.
Приборы и оборудование:.
1. Штаммы микроорганизмов и линии клеток.
1.1. Штаммы Escherichia coli.
1.2. Штаммы Saccharomyces cerevisiae.
1.3. Линия клеток человека.
2. Условия выращивания организмов.
Дрожжевые питательные среды.
3. Генно-инженерные конструкции.
4. Генно-инженерные методы.
4.1. Полимеразная цепная реакция (ПЦР).
4.2. Расщепление ДНК эндонуклеазами рестрикции и дефосфорилирование.
4.3. Лигирование.
4.4. Обратная транскрипция и амплификация.
5. Определение нуклеотидной последовательности ДНК методом Сэнгера.
6. Трансформация клеток Е.coli.
7. Трансформация Saccharomyces cerevisiae плазмидной ДНК.
8. Трансформация Saccharomyces cerevisiae библиотекой кДНК.
9. Определение фенотипов штаммов дрожжей S. cerevisiae.
10. Исключение плазмиды, содержащей маркер URA3, из дрожжевых клеток.
11. Определение активности р-галактозидазы.
11.1. Определение активности р-галактозидазы с помощью иммобилизации клеток на нитроцеллюлозных фильтрах.
11.2. Определение активности р-галактозидазы с использованием раствора X-gal в 0.5% агаре.
12. Скрещивание дрожжей.
13. Выделение ДНК из клеток дрожжей.
14. Выделение митохондриальных РНК из дрожжей.
14.1.Выделение митохондрий.
14.2. Выделение митохондриальных РНК.
15. Выделение суммарных клеточных РНК из дрожжей.
16. Гибридизация по Нозерну.
17. Western-гибридизация.
18. Мечение тРНК для реакций импорта.
19. Проверка ам?юацилирования РНК методом перйодатного окисления и мечения с использованием РНК-лигазы.
20. Транспорт радиоактивно меченной ТРК1 в изолированные митохондрии.
20.1. Выделение белкового препарата, способного направлять импорт тРНК в изолированные митохондрии дрожжей.
20.2. Выделение митохондрий из клеток дрожжей.
20.3. Исследование импорта РНК в изолированные митохондрии.
21. Выделение митохондрий из клеток человека.
22. Выделение митохондрий из гепатоцитов быка.
23. Измерение активности протеасомы in vitro.
24. Локализация митохондриальных белков.
24.1. Получение 358-меченных белков.
24.2. Импорт 358-меченных белков в изолированные митохондрии дрожжей.
25. Локализация З53-меченых енолаз в митохондриальной фракции дрожжей.
26. Конфокальная микроскопия клеток дрожжей.
27. Определение энзиматической активности гликолитических ферментов.
28. Выделение фракции, обогащенной внешними мембранами митохондрий дрожжей
29. Двумерный нативный электрофорез по Шагеру и фон Ягову.
29.4. Western-гибридизация BN-PAGE.
30. Иммунопреципитация.
31. Методы масс-спектрометрического анализа.
31.1. Визуализация белков в ПААГ.
31.2. Расщепление белков трипсином в геле.
31.3. MALDI- TOF анализ.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.
1. Поиск потенциальных факторов импорта тРНК с использованием дву- и тригибридных систем в дрожжах.
1.1. Поиск белков, взаимодействующих с pre-Msklp в двугибридной системе.
1.1.1. Метод двугибридной системы в дрожжах.
1.1.2. Скрининг библиотек кДНК для поиска белков, связывающих pre-Msklp.
1.2. Поиск белков, взаимодействующих с импортируемой тРНК.
1.3. Функциональный анализ роли потенциальных факторов импорта.
1.3.1. Роль убиквитин-протеасомной системы в импорте тРНК.
A. Возможная роль субъединицы протеасомы Rpnl3p в импорте тРНК.
Б. Doalp как фактор импорта и компонент UFD-пути.
B. Влияние остановки каталитической функции УПС на эффективность импорта ТРК1 в митохондрии дрожжей.
В.1. Анализ уровня импорта тРНК в митохондрии штаммов, дефектных по каталитической функции протеасомы.
В.2. Использование ингибитора протеасомы и цистеиновых протеиназ MG132.
1.3.2. Анализ роли других потенциальных факторов импорта.
A. Регулятор транскрипции Mthl.
Б. Ингибитор протеин-киназ - PILI.
B. Белки, специфически связывавшиеся с ТРК1 в тригибридной системе, - PNC1 и
LEU9.
Г. Транспортер магния - ALR1.
Д. РНК-зависимые хеликазы DRS1 и SEN1.
2. Новые функции енолазы как фактора импорта тРНК.
2.1. Анализ локализации енолазы в клетках дрожжей in vivo с использованием Western-гибридизации.
2.2. Локализация Епо2р, меченной YFP, в клетках дрожжей.
2.3. Енолаза, связанная с митохондриями, является функционально активной?. 149 3. Анализ митохондриальных комплексов, содержащих енолазу.
A. Использование двумерного нативиого электрофореза.
Б. Использование иммунопреципитации с антителами к енолазе.
B. Сравнение и анализ результатов, полученных двумя методами.
ВЫВОДЫ.