Шевякова Ксения Александровна. Разработка ПЦР-тест-системы для контроля качества продуктов переработки плодово-ягодного сырья

brief description

Шевякова Ксения Александровна. Разработка ПЦР-тест-системы для контроля качества продуктов переработки плодово-ягодного сырья: диссертация ... кандидата Технических наук: 05.18.15 / Шевякова Ксения Александровна;[Место защиты: ФГБОУ ВО «Кемеровский технологический институт пищевой промышленности (университет)»], 2016.- 163 с.

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ
РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ РФ
Федеральное государственное бюджетное
образовательное учреждение высшего образования
«Кемеровский технологический институт пищевой промышленности (университет)»
(ФГБОУ ВО КемТИПП)
Шевякова Ксения Александровна
РАЗРАБОТКА ПЦР-ТЕСТ-СИСТЕМЫ ДЛЯ КОНТРОЛЯ КАЧЕСТВА
ПРОДУКТОВ ПЕРЕРАБОТКИ ПЛОДОВО-ЯГОДНОГО СЫРЬЯ
05.18. 1 5 -Технология и товароведение пищевых продуктов функциональ¬ного и специализированного назначения и общественного питания
ДИССЕРТАЦИЯ
на соискание ученой степени
кандидата технических наук
Научный руководитель:
кандидат технических наук, доцент Козлова Оксана Васильевна
Кемерово 2016 
СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ 4
ГЛАВА 1 АНАЛИТИЧЕСКИЙ ОБЗОР 9
1.1 Современное состояние и перспективы производства продуктов
переработки плодово-ягодного сырья
1.2 Общие сведения о подлинности и фальсификации товаров 13
1.3 Понятие идентификации товаров и ее роль при оценке качества
товаров 22
1.4 Методы идентификации продовольственных товаров 28
1.5 Современные методы ДНК-диагоностики в идентификации продо¬вольственных товаров 35
ГЛАВА 2 ОРГАНИЗАЦИЯ, ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ПРОВЕДЕНИЯ ИССЛЕДОВАНИЙ 42
2.1 Структура и организация исследований 42
2.2 Объекты исследований 45
2.3 Методы исследований 46
ГЛАВА 3 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 55
3.1 Изучение потребительских предпочтений к продуктам переработки плодо¬во-ягодного сырья 55
3.2 Исследование компонентов растительных объектов, оказывающих
влияние на специфичность полимеразной цепной реакции 64
3.2. 1 Определение содержания веществ фенольной природы 65
3.2.2 Определение содержания полисахаридов в составе плодово-ягодного
сырья 68
3.2.3 Определение содержания общего белка и его фракционного состава.. 69
3.3. Сравнительная оценка методов экстракции ДНК из растительного
сырья и продуктов переработки на его основе 74
3.4 Компьютерный анализ первичных структур и построение филогене¬тических дендограмм 81
3. Конструирование универсальных праймеров, определение оптимальных параметров проведения ПЦР 87
3.6 Определение чувствительности ПЦР-тест-системы при идентифика¬ции вида сырья в пищевых системах 101
3.7 Влияние способов температурной обработки на эффективность видо¬вой идентификации ПЦР-тест-системы 105
3.8 Идентификация вида плодово-ягодного сырья в многокомпонент¬ной пищевой системе традиционными методами и методом ПЦР 109
ГЛАВА 4 ПРАКТИЧЕСКАЯ РЕАЛИЗАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ 121
ВЫВОДЫ 123
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ 126
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК 127
ПРИЛОЖЕНИЯ 152

bibliography

ВЫВОДЫ
По результатам исследований были сделаны следующие выводы:
1. Исследованы потребительские предпочтения к продуктам перера¬ботки плодово-ягодного сырья. Установлено, что 41 % респондентов отдают предпочтения при покупке джемам, 34% опрошенных употребляют его регу¬лярно (не реже 1 раза в неделю). Приоритетное значение при выборе среди оп¬рошенных респондентов отводится именно показателям качества пищевого продукта - вкусу и запаху, внешнему виду и цвету. Также установлено, что большинство из опрошенных термин «фальсификация» продуктов питания трактуют как «продукты содержащие ГМО».
2. Для предотвращения процесса ингибирования полимеразной цепной реакции исследован компонентный состав Rubus idaeus, Fragari; Ribes uva- crispa, Rosa. Полученные результаты показали биохимическую «проблем- ность» данного плодово-ягодного сырья как носителя большого количества веществ (полифенолов, полисахаридов, белков), ингибирующих ПЦР.
3. Приведен сравнительный анализ методов экстракции ДНК из расти-тельных объектов с целью выявления наиболее продуктивного. В сравнитель¬ных опытах установлено преимущество набора реагентов «Сорб-ГМО-А», по¬зволяющего получить высокоочищенную ДНК. Соотношение показателей пре¬ломления А26О/28О в плодово-ягодном сырье составило от 1 ,99 до 2,03 в джемах от 1 ,97 до 2,00, при этом концентрация выделенной ДНК составляла 0,42-0,45 мг/г и 0,42-0,44 мг/г соответственно.
4. Выполнен анализ всех имеющихся нуклеотидных последовательно¬стей генов плодово -ягодного сырья в международном банке генов. Сравни¬тельный анализ фрагментов генов Rubus idaeus, Fragari; Ribes uva-crispa, Rosa позволил выявить консервативные участки для создания специфических прай¬меров.
5. С помощью теоретических расчетов и компьютерного моделирования сконструированы видоспецифические праймеры для проведения дифферен¬циации различных образцов плодово-ягодного сырья.
6. В процессе оптимизации условий проведения ПЦР подобраны и отра¬ботаны режимы и параметры проведения ПЦР: температуры отжига праймеров, температуры денатурации, продолжительности денатурации и количество цик¬лов. В результате серии экспериментов установлены следующие параметры проведения амплификации с: 950С - 200 с- 1 цикл, 640С -5 0 с - 35 циклов, 72 0С - 1 20 с - 1 цикл.
7. Результаты оценки чувствительности разработанной ПЦР-системы показали возможность выявления фальсификации плодово-ягодного сырья и продуктов его переработки (на примере малины, земляники, крыжовника и ши-повника) с применением видоспецифичных праймеров. Установлена чувстви-тельность метода ПЦР - разработанная ПЦР-система обеспечивает выявление ДНК в сложных пищевых системах, если доля сырья составляет три и более процента.
8. При исследовании влияния способов технологической обработки на эффективность видовой идентификации тест-системы, доказана термическая устойчивость фосфатных связей полинуклеотидной цепи ДНК плодово - ягодного сырья. Тем самым отражена возможность применения полимеразной цепной реакции (ПЦР) при исследовании объектов, прошедших тепловую об¬работку свыше 1 00 °С
9. Проведена качественная идентификация вида плодово-ягодного сырья в многокомпонентной пищевой системе - джеме методами, регламентируемыми нормативной документацией, методом ПЦР и методом ИК-Фурье. В ходе сравни-тельного анализа установлено, что разработанная ПЦР-тест-система дает более точное представление о видовой принадлежности входящего о состав джемов сы¬рья. Применение метода ИК-Фурье спектроскопии для идентификации плодово¬ягодного сырья в сложных пищевых системах показало, что данный метод позво¬ляет определить наличие в продукте плодово-ягодного сырья, но идентифициро¬вать его видовую принадлежность не представляется возможным.
В результате молекулярно-генетических приемов разработана тест - система, предназначенная для идентификации видоспецифичной ДНК биологи¬ческих объектов растительного происхождения методом ПЦР, и выявления возможной фальсификации, связанной с замещением сырьевого состава. Дан¬ная система позволяет совершенствовать контроль качества продуктов питания, снижая при этом вероятность ошибок оператора и риск контаминации реакти¬вов при приготовлении смеси, повышает воспроизводимость результатов, а также уменьшает время и трудоемкость анализа