Шнайдер Ксения Леонидовна. Ферментативный гидролиз растительных масел с использованием неводных сред

brief description

Шнайдер Ксения Леонидовна. Ферментативный гидролиз растительных масел с использованием неводных сред : диссертация ... кандидата химических наук : 02.00.15 / Шнайдер Ксения Леонидовна; [Место защиты: Казан. гос. технол. ун-т].- Казань, 2009.- 136 с.: ил. РГБ ОД, 61 10-2/177

Казанский государственный технологический университет
И'
На правах рукописи 04201053^73
ШНАЙДЕР КСЕНИЯ ЛЕОНИДОВНА
ФЕРМЕНТАТИВНЫЙ ГИДРОЛИЗ РАСТИТЕЛЬНЫХ МАСЕЛ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ НЕВОДНЫХ СРЕД
02.00.15 - Катализ
Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук
Научный руководитель - доктор химических наук, профессор B.C. Гамаюрова
Казань — 2009
ВВЕДЕНИЕ 5
Глава 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 9
1.1 Ферменты в неводных средах 9
1.1.1 Выбор растворителя для проведения реакции 11
1.1.2 Основные подходы к реализации процессов, протекающих в средах с низким содержанием воды (макрогетерогенные двухфазные системы, микрогетерогенные реакционные среды) 15
1.1.2.1 Макрогетерогенные двухфазные системы 15
1.1.2.1.1 Системы жидкость - жидкость 15
1.1.2.1.2 Системы жидкость - твердая фаза 17
1.1.2.2 Микрогетерогенные реакционные среды 19
1.1.2.2.1 Система обращенных мицелл 19
1.1.2.2.2 Бездетергептные микроэмульсии 24
1.1.2.2.3 Ферменты, модифицированные полиэтиленгликолем 24
1.2 Липазы в неводных средах 25
1.2.1 Липазы общая характеристика 25
1.2.2 Применение липаз в неводных средах 30
1.3 Полиненасыщенные жирные кислоты семейства со-З 33
1.3.1 Значение полиненасыщенных жирных кислот семейства со-З 33
1.3.2 Источники полиненасыщенных жирных кислот семейства со-З 37
1.4 Модификация жиров и масел липазами 42
1.4.1 Химический и ферментативный гидролиз жиров и масел 42
1.4.2 Химическая и ферментативная переэтерификацйя жиров и масел 44
1.4.3 Иммобилизация липаз 47
Глава 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 51
2.1 Материалы 51
2.1.1 Ферментные препараты 51
2.1.2 Субстраты 51
2.1.3 Детергенты 52
2.1.4 Растворители и другие реагенты 52
2.2 Методы исследования 53
. 2.2.1 Определение активности липазы (модифицированный метод Ота,
Ямада) 53
2.2.2 Влияние ионов металлов на активность ферментного препарата панкреатической липазы 54
2.2.3 Колориметрический метод определения активности ферментных препаратов липаз 55
2.2.5 Иммобилизация ферментных препаратов липаз 56
2.2.6 Изучение процесса ферментативного гидролиза иммобилизованными препаратами липаз 57
2.2.7 Иммобилизация ферментного препарата панкреатической липазы в гель агара в присутствии АОТ 58
2.2.8 Гидролиз льняного и рапсового масел ферментными препаратами липаз в системе масло/вода 59
2.2.9 Получение натриевых солей жирных кислот 59
2.2.10 ИК-спектроскопия полученных образцов 59
2.2.11 Определение качественного и количественного состава высших жирных кислот методом газожидкостной хроматографии 59
2.2.12 Получение кальциевых солей жирных кислот 60
2.2.13 ИК-спектроскопия кальциевых солей жирных кислот 60
2.2.14 Анализ липидов методом тонкослойной хроматографии 60
2.2.15 Обработка полученных результатов 61
Глава 3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 62
3.1 Гидролиз льняного и рапсового масел ферментными препаратами липаз в системе масло/вода .' 64
3.2 Гидролиз растительных масел ферментными препаратами липаз. Мицеллярные системы 75
3.2.1 Гидролиз льняного и рапсового масел ферментным препаратом панкреатической липазы 76
3.2.2 Гидролиз льняного масла липазой из Candida rugosa 93
3.3 Активация и стабилизация ферментного препарата панкреатической липазы неорганическими соединениями 105
3.4 Иммобилизация ферментных препаратов липаз в гель агара 110
3.4.1 Проведение ферментативного гидролиза иммобилизованными
препаратами липаз 117
ВЫВОДЫ 121
Список использованных источников 123
Актуальность работы. Ферментные препараты находят все более широ¬кие области применения в биотехнологии пищевой, фармацевтической, косме¬тической и других отраслях промышленности. Сравнительно новое направле¬ние - изучение применения ферментных препаратов в неводных средах, что по¬зволяет значительно расширить круг объектов и процессов, для которых могут быть использованы ферментные препараты.
В настоящей работе объектами исследования являются растительные масла различного жирно-кислотного состава — льняное и рапсовое масла. Эти масла важны, как для пищевой промышленности, так и для технических целей. Так, химический гидролиз рапсового масла является основой для крупнотоннажного получения ПАВ.
К перспективнейшим объектам исследования среди растительных масел можно отнести льняное масло, содержание ш-З ПНЖК (а-линоленовой кисло¬ты) в котором составляет 35-65 % к сумме кислот. Благодаря своему жирно¬кислотному составу и присутствию антиоксидантов льняное масло использует¬ся для профилактики и комплексного лечения многих заболеваний.
Наряду с льняным маслом неплохим источником а-линоленовой кислоты может служить рапсовое масло.
Современные сорта рапса содержат 40-49 % масла, богатого олеиновой (45-70 %), линолевой (15-28 %) и линоленовой (6-13 %) кислотами, вследствие чего рапсовое масло можно отнести к ценным растительным маслам.
Изучение процесса ферментативного гидролиза растительных масел акту¬ально с точки зрения получения свободных высших жирных кислот, которые имеют очень широкий спектр применения. Ферментативные процессы, как из¬вестно, протекают в мягких условиях и обладают более выраженной селектив- ностью.
Для пищевой промышленности указанные масла представляют ценность, как источники незаменимых оо-З и ш-6 полиненасыщенных жирных кислот (ПНЖК) - линолевой и а-линоленовой кислот, которые выполняют функцию осо¬бого витамина, получившего наименование витамин F. ПНЖК семейства со-3 и ю-6 обладают широким спектром лечебно-профилактического действия, так как они являются биологическими предшественниками эйкозаноидов и структурными блоками биологических мембран.
В связи с этим интерес исследователей различного профиля к незамени¬мым ПНЖК семейств со-3 и ю-6 чрезвычайно высок. При этом если источники ПНЖК семейства со-6 довольно распространены, то гораздо более ограничен круг источников ПНЖК семейства со-3. Поэтому поиск новых источников со-3 ПНЖК, доступных и легко усвояемых является актуальной задачей. Для полу¬чения продуктов с повышенным содержанием со-3 ПНЖК, а, следовательно, с повышенной пищевой ценностью была использована ферментативная транс¬формация растительных масел липазами различного происхождения.
Цель и задачи исследования. Выявление особенностей ферментативного гидролиза растительных масел различного жирио-кислотного состава липазами животного и микробиологического происхождения.
Получение нового модифицированного липидного продукта с повышен¬ным содержанием со-3 ПНЖК, а, следовательно, с повышенной пищевой ценно¬стью.
Научная новизна. Панкреатическая липаза и липаза из Candida rugosa гидролизуют растительные масла в органических средах (углеводороды) в ми- целлярных системах АОТ гораздо эффективнее, чем в эмульсии масло/вода стабилизированной АОТ.
Панкреатическая липаза в системе обращенных мицелл АОТ специфична по отношению к жирно-кислотному составу гидролизуемых масел и легче от¬деляет в ацил глицеридах остатки полиненасыщенных жирных кислот, чем на¬сыщенных и мононенасыщенных.
Липаза из Candida rugosa в системе масло/вода гораздо эффективнее под¬вергает гидролизу растительные масла, чем панкреатическая липаза, при этом она труднее всего отделяет в ацилглицеридах остатки полиненасыщенной а- линоленовой кислоты, что позволяет получить модифицированные масла с по¬вышенным относительным содержанием этой кислоты.
Практическая значимость. Разработан метод гидролиза льняного масла с применением липазы из Candida rugosa в отсутствии эмульгатора, что позво¬ляет получить биологически-активный липидный продукт с повышенным отно¬сительным содержанием со-З-ПНЖК.
Подобраны оптимальные условия для получения активных иммобилизо¬ванных препаратов липаз различного происхождения. Показано, что при иммо¬билизации необходимо введение хлорида кальция в гель агара и подобраны его оптимальные концентрации.
Разработан метод выделения кальциевых и натриевых солей жирных ки¬слот льняного масла, который включает последовательную ферментативную и химическую обработку масла. Данные соли находят применение в качестве до¬бавок к корму сельскохозяйственных животных, а также могут использоваться как основа для получения ПАВ, восков и др.
Апробация работы. Результаты работы были доложены на Международ¬ной научно-практической конференции “Биотехнология. Вода и пищевые про¬дукты” (Москва, 2008), на X Международной конференции молодых ученых “Пищевые технологии и биотехнологии” (Казань, 2009), на XIV Международ¬ной конференции, посвященной 20-летию партнерства между Казанским госу¬дарственным университетом и Гиссенским университетом им. Ю. Либиха (Ка¬зань, 2009), на ежегодных отчетных конференциях КГТУ (2007-2009).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 12 работ.
Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, результатов и их об¬суждения (3 главы), выводов и библиографического указателя (129 наименова-
ний источников). Работа изложена на 136 страницах машинописного текста, включает в себя 19 таблиц и 43 рисунка.

bibliography

выводы
1. Гидролиз льняного масла липазой из Candida rugosa в системе мас-ло/вода без внесения эмульгатора, позволяет выделить липидный продукт, обо-гащенный а-линоленовой кислотой. Относительное содержание ценной со-3- ПНЖК в липидном продукте увеличилось с 49,5 % до 66,7 %.
Установлено, что в данной системе липаза из Candida rugosa проявляет более высокую специфичность по отношению к насыщенным, а также моно- и диненасыщенным жирным кислотам. Для выделения высших жирных кислот и отделения их от модифицированного масла (липидного продукта) применен метод холодной рафинации.
Панкреатическая липаза в системе масло/вода практически не осуществ¬ляет гидролиз растительных масел.
2. Установлено, что панкреатическая липаза способна расщеплять льня-ное масло в системе обращенных мицелл АОТ в среде декана в 3,3 раза эффек¬тивнее, чем в эмульсии масло/вода, стабилизированной АОТ. Гидролиз рапсо¬вого масла в среде гексана в 16,5 раз эффективнее гидролиза стабилизирован¬ной АОТ эмульсии масло/вода.
Определены оптимальные условия для проведения гидролиза льняног о и рапсового масел ферментным препаратом панкреатической липазы. Выход жирных кислот в оптимальных условиях составил 85 % для льняного масла и 45 % — для рапсового масла.
3. Фермент панкреатическая липаза в системе обращенных мицелл АОТ специфичен по отношению к жирно-кислотному составу гидролизуемых масел и легче отделяет в ацилглицеридах остатки полиненасыщенных жирных ки¬слот, чем остатки насыщенных и мононенасыщенных кислот, что приводит к тому, что в системе обращенных мицелл АОТ в среде декана льняное масло гидролизуется почти в 2 раза эффективнее рапсового масла.
4. Установлено, что гидролиз льняного масла липазой из Candida rugosa в системе мицелл АОТ лучше всего протекает в среде гептана и в 3,6 раз более эффективен, чем в эмульсии масло/вода, стабилизированной АОТ. Выход жир¬ных кислот в оптимальных условиях составил 36 %.
5. Установлено, что на липолитическую активность и стабильность фер-ментного препарата панкреатической липазы оказывают активирующий эффект хлориды кальция и магния, сульфат магния. Подобраны оптимальные концен¬трации активирующих добавок.
6. Получены иммобилизованные препараты липаз с высокой удельной активностью. Активность иммобилизованных ферментных препаратов выше липолитической активности исходных ферментов: ферментного препарата пан-креатической липазы — в 12,4 раза; липазы из Candida rugosa - в 5 раз, препара¬та “Novozyrae 868” - в 11,6 раз.
1. Варфоломеев, С.Д. Химическая энзимология / С.Д. Варфоломеев. - М.: Издательский центр «Академия», 2005. — 480 с.
2. Кирейко, А.В. Ферментативное определение рядя лекарственных ве-ществ в прямых и обращенных мицеллах додецилсульфата натрия / А.В. Ки¬рейко, И.А. Веселова, Т.Н. Шеховцова // Вест. Моск. Ун-та. Сер. 2. Химия. - 2007. - Т. 48, № 4. - С. 255-270.
3. Kobayashi Т. Reaction equilibrium for lipase-catalyzed condensation in or-ganic solvent systems / T. Kobayashi, S. Adachi // Biotechnol. Lett. - 2004. - Vol. 26, № 19.-P. 1461-1468.
4. Мартинек, К. Сдвиг химического равновесия в двухфазных водно-органических системах и препаративный органический синтез / К. Мартинек, А.Н. Семенов, И.В. Березин // Доклады академии наук. — 1980. - Т. 252, № 2. - С. 394-398.
5. Поверхностно-активные вещества и полимеры в водных растворах / К. Холмберг [и др.]; пер. с англ. - М.: БИНОМ. Лаборатория знаний, 2007. - 528 с.
6. Enhanced activity and stability of ionic liquid-pretreated lipase / D. T. Dang [et al.] // Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic. - 2007. -№ 45. - P. 118-121.
7. Неклюдов, А.Д. Биохимическая переработка жиров и масел в новые ли-пидные продукты с улучшенными биологическими и физико-химическими свойствами (обзор) / А.Д. Неклюдов, А.М. Иванкин // Прикладная биохимия и микробиология. - 2002. - Т. 38, № 5. - С. 469 - 481.
8. Биотехнология: учеб. пособие для вузов.: в 8 кн. / под ред. Н.С. Егоро-ва, В.Д. Самуилова. — Кн. 7: Иммобилизованные ферменты / И.В. Березин [и др.] - М.: Высшая школа, 1987. - 159 с.
9. Халгаш, Я. Биокатализаторы в органическом синтезе / Я. Халгаш; пер. со словац. - М.: Мир, 1991. — 204 с.
10. Конструирование биокаталитических систем в органических раство¬рителях с малым содержанием воды / Ю.Л. Хмельницкий [и др.] // Биотехноло¬гия. - 1988. - Т. 4, № 3. - С. 292-303.
11. Ферментативные реакции в водно-органических смесях: критерий для выбора оптимального органического растворителя / А.М. Клибанов [и др.] // Биоорганическая химия. - 1978. - Т. 4, № 1. - С. 82-87.
12. Sivalingam G. Solvent effects on the lipase catalyzed biodegradation of poly(E-caprolactone) in solution / G. Sivalingam, S. Chattopadhyay, G. Madras // Po- lym. Degrad, and Stab.— 2003. - Vol. 79, № 3. - P. 413-418.
13. Сироткин, В.А. УФ-спектрофотометрическое изучение связывания профлавина бычьим панкреатическим а-химотрипсином в смесях вода- ацетонитрил / В.А. Сироткин, Т.А. Мухаметзянов, Б.Н. Соломонов // Вест. Моск. Ун-та. Сер. 2. Химия. - 2003. - Т. 44, № 1. - С. 19-24.
14. Stability of hydrolytic enzymes in water-organic solvent systems / L.M. Simon [et al.] // Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic. - 1998. - Vol. 4, № 1-2.-P. 41-45.