Сиквенс-специфические олигонуклеотид-пептидные конъюгаты и N-(метансульфонил)фосфорамидные аналоги антисмысловых олигонуклеотидов как ингибиторы онкогенных миРНК in vitro и in vivo Гапонова Светлана Константиновна

brief description

Гапонова,СветланаКонстантиновна.Сиквенс-специфическиеолигонуклеотид-пептидныеконъюгатыиN-(метансульфонил)фосфорамидныеаналогиантисмысловыхолигонуклеотидовкакингибиторыонкогенныхмиРНКINVITROиINVIVO: диссертация ... кандидата биологических наук : 03.01.04 /ГапоноваСветланаКонстантиновна; [Место защиты: Институт химической биологииифундаментальной медицины СО РАН]. - Новосибирск, 2020. - 170 с. : ил.больше
Цитаты из текста:

стр. 1
медицины На правах рукописиГапоноваСветланаКонстантиновнаСИКВЕНС-СПЕЦИФИЧЕСКИЕОЛИГОНУКЛЕОТИД-ПЕПТИДНЫЕКОНЪЮГАТЫИ N-(МЕТАНСУЛЬФОНИЛ)ФОСФОРАМИДНЫЕАНАЛОГИАНТИСМЫСЛОВЫХОЛИГОНУКЛЕОТИДОВКАКИНГИБИТОРЫОНКОГЕННЫХмиРНКINVITROИ INVIVO03.01.04 Биохимия Диссертация на соискание ученой степени кандидата

стр. 4
анализ данных ........................................................................................ 63 Глава 3.Сиквенс-специфическиеолигонуклеотид-пептидныеконъюгатыи N(метансульфонил)фосфорамидныеаналогиантисмысловыхолигонуклеотидовкакингибиторыонкогенныхмиРНКinvitroи invivo(Результаты и их обсуждение).............................................. 64 3.1 Разработка...

стр. 63
версии 10.0. 64 Глава 3.Сиквенс-специфическиеолигонуклеотид-пептидныеконъюгатыи N-(метансульфонил)фосфорамидныеаналогиантисмысловыхолигонуклеотидовкакингибиторыонкогенныхмиРНК invitroи invivo(Результаты и их обсуждение) 3.1 Разработка миРНК-направленныхолигонуклеотид-пептидныхконъюгатов

Оглавление диссертациикандидат наук Гапонова Светлана Константиновна
Список сокращений
Введение
Глава 1. Направленная регуляция активности опухоль-ассоциированных миРНК под действием различных вариантов олигонуклеотидных конструкций (Обзор литературы)
1.1 Различные сценарии биогенеза миРНК
1.2 Внутриклеточные механизмы утилизации миРНК
1.3 Роль миРНК при онкологических заболеваниях
1.4 Стратегии управления активностью миРНК, основанные на применении терапевтических нуклеиновых кислот
1.5 Препараты на основе нуклеиновых кислот для терапии миРНК-ассоциированных онкологических заболеваний, находящиеся в клинических испытаниях
1.6 Комбинации препаратов на основе нуклеиновых кислот для модуляции активности миРНК в опухолевых клетках
1.6.1 Комбинации миРНК-направленных олигонуклеотидов для одновременного подавления нескольких событий канцерогенеза
1.6.2 Комбинации миРНК-мимиков для терапевтического воздействия на определенную функцию клеток
1.6.3 Комбинации препаратов, направленных на модуляцию опухолеассоциированных миРНК, и цитостатиков для преодоления лекарственной устойчивости опухолевых клеток
1.7 Заключение
Глава 2. Экспериментальная часть
2.1 Материалы
2.1.1 Реактивы и препараты
2.1.2 Оборудование
2.1.3 Олигонуклеотиды и олигонуклеотид-пептидные конъюгаты
2.1.4 Буферы и растворы
2.1.5 Трансфицирующие агенты
2.1.6 Клеточные культуры
2.1.7 Лабораторные животные
2.2 Методы
2.2.1 Гель-Электрофорез
2.2.1.1 Электрофорез в полиакриламидном геле (ПААГ) в нативных условиях
2.2.1.2 Электрофорез в ПААГ в денатурирующих условиях
2.2.2 Введение радиоизотопной метки по 5'-концу миРНК с использованием полинуклеотидкиназы
2.2.3 Исследование гибридизационных свойств олигонуклеотидов и олигонуклеотид-пептидных конъюгатов методом задержки в геле
2.2.4 Анализ термостабильности комплексов олигонуклеотидов с миРНК
2.2.5 Исследование эффективности расщепления миРНК олигонуклеотид-пептидными конъюгатами
2.2.6 Исследование эффективности расщепления миРНК в гетеродуплексах с олигонуклеотид-пептидными конъюгатами и химически модифицированными олигонуклеотидами в присутствии РНКазы Н
2.2.6.1 Исследование эффективности расщепления миРНК под действием РНКазы Н в гетеродуплексе с олигонуклеотид-пептидными конъюгатами
2.2.6.2 Исследование эффективности расщепления миРНК под действием РНКазы Н в гетеродуплексе с антисмысловыми олигонуклеотидами
2.2.7 Частичный гидролиз РНК в денатурирующих условиях
2.2.7.1 Частичное расщепление 5'-[32Р]-миРНК-21 РНКазой Т1
32
2.2.7.2 Частичное расщепление 5' -[Р]-миРНК-21 в имидазольном буфере
2.2.8. Анализ эффективности гибридизации и расщепления миРНК
2.2.9 Исследование стабильности химически модифицированных олигонуклеотидов и олигонуклеотид-пептидных конъюгатов в ростовой среде и сыворотке крови мышей
2.2.9.1 Приготовление сыворотки крови мышей
2.2.9.2 Исследование нуклеазоустойчивости олигонуклеотидов и олигонуклеотид-пептидных конъюгатов
2.2.10 Приготовление комплексов катионных липосом и нуклеиновых кислот
2.2.11 Трансфекция опухолевых клеток олигонуклеотидами и олигонуклеотид-пептидными конъюгатами
2.2.12 Выделение суммарной клеточной РНК из опухолевых клеток и ткани
2.2.13 Исследование влияния олигонуклеотид-пептидных конъюгатов и химически модифицированных олигонуклеотидов на пролиферацию опухолевых клеток в режиме реального времени с помощью системы хСеШ§епсе
2.2.14 Исследование влияния олигонуклеотид-пептидных конъюгатов на инвазивные свойства опухолевых клеток с использованием матригеля и системы хСеШ§епее
2.2.15 Исследование влияния олигонуклеотид-пептидных конъюгатов и химически модифицированных олигонуклеотидов на миграционную активность опухолевых клеток методом зарастания царапины (scratch теста)
2.2.16 Исследование индукции апоптоза в опухолевых клетках под действием олигонуклеотид-пептидных конъюгатов и химически модифицированных олигонуклеотидов методом окрашивания клеток Аппехт V-FITC/PI
2.2.17 Исследование противоопухолевой активности олигонуклеотид--пептид ных конъюгатов ex vivo
2.2.18 Исследование биораспределения химически модифицированных олигонуклеотидов
2.2.19 Исследование противоопухолевой активности модифицированных олигонуклеотидов in vivo
2.2.20 Определение уровня миРНК в опухолевых клетках и опухолевой ткани методом количественной ОТ-ПЦР
2.2.20.1 Обратная транскрипция
2.2.20.2 ПЦР в режиме реального времени
2.2.21 Определение уровня белков-мишеней миРНК в опухолевых клетках и опухолевой ткани методом Вестерн блот гибридизации
2.2.21.1 Приготовление лизата из опухолевых клеток и опухолевой ткани
2.2.21.2 Вестерн блот гибридизация
2.2.22 Гистологический анализ опухолевых тканей и внутренних органов мышей после терапии химически модифицированными олигонуклеотидами
2.2.23 Статистический анализ данных
Глава 3. Сиквенс-специфические олигонуклеотид-пептидные конъюгаты и N-(метансульфонил)фосфорамидные аналоги антисмысловых олигонуклеотидов как ингибиторы онкогенных миРНК in vitro и in vivo (Результаты и их обсуждение)
3.1 Разработка миРНК-направленных олигонуклеотид-пептидных конъюгатов и исследование их биологических свойств
3.1.1 Исследование биологических свойств миРНК-направленных искусственных рибонуклеаз, содержащих в качестве адресующей компоненты немодифицированные олигодезоксирибонуклеотиды
3.1.1.1 Дизайн олигонуклеотидов, выступающих в качестве адресующей компоненты миРНК-направленных иРНКаз
3.1.1.2 Исследование гибридизационных и термодинамических свойств олигонуклеотидов. Скрининг и выбор перспективных кандидатов для синтеза иРНКаз
3.1.1.3 Дизайн миРНК-направленных иРНКаз
3.1.1.4 Исследование гибридизационных свойств иРНКаз
3.1.1.5 Исследование рибонуклеазной активности иРНКаз в условиях однооборотной и многооборотной реакций
3.1.1.5.1. Исследование рибонуклеазной активности иРНКаз в условиях однооборотной реакции
3.1.1.5.2. Исследование рибонуклеазной активности иРНКаз в условиях многооборотной реакции
3.1.1.6 Исследование каталитической активности иРНКаз в присутствии РНКазы Н
3.1.1.7 Исследование биологической активности миРНК-направленных иРНКаз на культурах опухолевых клеток
3.1.1.7.1 Исследование нуклеазоустойчивости миРНК-направленных иРНКаз в ростовой среде в присутствии сыворотки
3.1.1.7.2 Исследование рибонуклеазной активности некомплементарного контрольного конъюгата
3.1.1.7.3 Влияние миРНК-направленных иРНКаз на уровень миРНК и её белков мишеней в клетках лимфосаркомы КЬ840
3.1.1.7.4 Влияние миРНК-направленных иРНКаз на пролиферацию опухолевых клеток лимфосаркомы КЬ840
3.1.1.7.5 Влияние миРНК-направленных иРНКаз на инвазию и апоптоз клеток меланомы В16
3.1.1.8 Влияние миРНК-направленных иРНКаз на рост лимфосаркомы КЬ840 у мышей
3.1.2 Влияние модификаций рибозофосфатного остова адресующего олигонуклеотида на биологические свойства миРНК-направленных искусственных рибонуклеаз
3.1.2.1 Дизайн миРНК-направленных иРНКаз, содержащих различный паттерн 2'ОМе-модификаций в области связывания с миРНК
3.1.2.2 Исследование гибридизационных свойств миРНК-направленных 2'ОМе-иРНКаз
3.1.2.3. Исследование рибонуклеазной активности миРНК-направленных 2'ОМе-иРНКаз
в условиях однооборотной и многообротной реакций
3.1.2.4. Исследование нуклеазоустойчивости миРНК-направленных 2'ОМе-иРНКаз в ростовой среде и в сыворотке крови мышей
3.1.2.5 Исследование биологической активности миРНК-направленных 2'ОМе-иРНКаз на культуре клеток эпидермоидной карциномы человека КВ-8-5
3.2 миРНК-направленные олигонуклеотиды, содержащие N
(метансульфонил)фосфорамидные (ц-) модификации межнуклеотидных связей. Сравнение с фосфотиоатными олигонуклеотидами
3.2.1 Дизайн миРНК-направленных ц-олигонуклеотидов
3.2.2 Исследование гибридизационных свойств ц-олигонуклеотидов
3.2.3 Исследование РНКаза Н-активирующей способности ц-олигонуклеотидов
3.2.4 Исследование нуклеазоустойчивости ц-олигонуклеотидов в ростовой среде
3.2.5 Исследование биологической активности ц-олигонуклеотидов на культуре клеток меланомы В16 мыши
3.2.5.1 Влияние ц-олигонуклеотидов на уровень миРНК в опухолевых клетках: концентрационные и кинетические параметры подавления онкогенных миРНК
3.2.5.2 Влияние ц-олигонуклеотидов на пролиферативный потенциал опухолевых клеток
3.2.5.3 Исследование индукции апоптоза в опухолевых клетках под действием ц-олигонуклеотидов
3.2.5.4 Влияние ц-олигонуклеотидов на миграционные свойства опухолевых клеток
3.2.5.5 Исследование биораспределения ц-олигонуклеотидов у мышей-опухоленосителей
3.2.6 Исследование биологической активности ц-олигонуклеотидов in vivo на модели эпидермоидной карциномы человека KB-8-5
3.2.6.1 Влияние ц-олигонуклеотидов на скорость роста опухоли KB-8-5 у мышей
3.2.6.2 Определение уровня миРНК-21 и её белков-мишеней в опухолевой ткани после терапии ц-олигонуклеотидами
3.2.7 Гистологический анализ опухолей KB-8-5 после терапии ц-олигонуклеотидами
3.2.8 Оценка токсичности ц-олигонуклеотидов
Заключение
Выводы
Список литературы
Приложение