Структурно-функциональное исследование транспортно-матричной РНК Escherichia coli Иванов, Павел Валерьевич

brief description

Иванов, Павел Валерьевич.
Структурно-функциональное исследование транспортно-матричной РНК Escherichia coli : диссертация ... кандидата химических наук : 02.00.10. - Москва, 2003. - 120 с. : ил.
Оглавление диссертациикандидат химических наук Иванов, Павел Валерьевич
СОДЕРЖАНИЕ.
1. СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ
2. ВВЕДЕНИЕ.
3. Терминация трансляции и процессы, конкурирующие с ней /Обзор литературы/
3.1.Терминация трансляции.
3.1.1. Историческая справка.
3.1.2. Терминация трансляции. Общие сведения.
3.1.3. Декодирующие факторы терминации.
3.1.4. Концепция „молекулярной мимикрии".
3.1.4.1. Предполагаемая „антикодоновая мимикрия".
3.1.5. Освобождение синтезированного полипептида с помощью факторов терминации.
3.1.6. Диссоциация пост-терминационного комплекса.
3.1.7. Диссоциация рибосом на субчастицы для последующих раундов трансляции.
3.2.Процессы, конкурирующие с терминацией трансляции.
3.2.1. Рекодирование стоп-кодонов.
3.2.1.1. Программированный трансляционный сдвиг рамки считывания и программированное прочтение стоп-кодонов.
3.2.1.2. Рекодирование стоп-кодона гена 60 бактериофага Т4 (translational hopping).
3.2.1.3.Включение селеноцистеина на стоп-кодоне UGA.
3.2.2. Конкуренция между терминацией трансляции и тмРНК.
3.2.3.Конкуренция между терминацией трансляции и бактериальным токсином RelE.
3.2.4.Триптофан как эффективный ингибитор терминации трансляции.
3.2.5. Деградация мРНК, содержащих преждевременный стоп-кодон (nonsense-mediated decay) в клетках эукариот.
4. Результаты и Обсуждение.
4.1. Неканонический комплекс между тмРНК и EF-Tu.
4.2. Модель взаимодействия тмРНК с рибосомой.
4.3. Поиск элемента тмРНК, обеспечивающего узнавание А участком рибосомы
4.4. Исследование роли некоторых консервативных нуклеотидов тмРНК.
4.5. Поиск интрамолекулярных супрессоров для летальных мутаций 85-86UA-+CC и 300-301UA—CC.
4.6. Мутации нуклеотидов тРНК-подобной части, затрагивающие активность тмРНК.
4.7. Разработка метода выделения комплекса транспортно-матричной РНК с рибосомой.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
5.1. Реактивы, буферы и растворы.
5.2. Биопрепараты.
6.3.Трансформация клеток Escherichia coli.
5.3.1. Приготовление компетентных клеток для трансформации с помощью теплового шока.
5.3.2. Приготовление компетентных клеток для электротрансформации.
5.4. Трансформация.
5.4.1. Электротрансформация клеток Е coli.
5.4.2. Трансформация с помощью теплового шока.
5.5. Клонирование гена, кодирующего тмРНК.
5.6. Создание генетической системы.
5.7. Конструирование плазмиды pStr.
5.8. Введение мутаций в ген, кодирующий тмРНК.
5.8.1. Сайт-направленный мутагенез.
5.8.2. Случайный мутагенез тмРНК in vivo и анализ мутантов.
5.9. Определение первичной структуры ДНК по Сэнгеру.
5.10. Анализ активности мутантных молекул тмРНК.
5.10.1. Анализ активности мутантных молекул тмРНК с помощью „генетической системы".
5.10.2. Определение активности молекул тмРНК с помощью гибридного фага МттР22.
5.10.3. Аминоацилирование тмРНК.
5.11. Получение S30 экстракта.
5.12. Выделение комплекса тмРНК, взаимодействующей с рибосомой.
5.12.1. Выделение комплекса тмРНК, взаимодействующей с рибосомой.
5.12.2. Выделение суммарной РНК комплекса.
5.12.3. Выделение суммарных белков комплекса.
5.13. Фотоаффинное химическое сшивание тмРНК.
5.13.1. Синтез тмРНК с помощью Т7-РНК-полимеразы.
5.13.2. Синтез 4-тиоуридин содержащей тмРНК с помощью Т7-РНК-полимеразы.
5.13.3. Фотоаффинное химическое сшивание тмРНК с фактором элонгации Ти или с S100 экстрактом.
5.13.4. Внутримолекулярное фотоаффинное химическое сшивание тмРНК .95 5.14. Анализ продуктов сшивания.
5.14.1. Анализ белкового компонента сшивки.95'
5.14.2. Анализ продуктов сшивания с помощью реакции обратной транскрипции
5.14.3. Гидролиз тмРНК с помощью РНКазы Н.
ВЫВОДЫ.