Структурно-функциональное изучение гомологичных фрагментов факторов дифференцировки PEDF и HLDF Жохов, Сергей Сергеевич

brief description

Жохов, Сергей Сергеевич.
Структурно-функциональное изучение гомологичных фрагментов факторов дифференцировки PEDF и HLDF : диссертация ... кандидата химических наук : 02.00.10. - Москва, 2004. - 142 с. : ил.
Оглавление диссертациикандидат химических наук Жохов, Сергей Сергеевич
ВВЕДЕНИЕ.
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ:ФАКТОР ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ РЕБР, ОБЛАДАЮЩИЙ НЕЙРОТРОФНЫМ И АНТИАНГИОГЕННЫМ
ДЕЙСТВИЕМ.
1. Идентификация фактора РЕБР в различных типах клеток.
1.1. Идентификация РЕББ в культуральной среде клеток пигментного эпителия сетчатки глаза человека.
1.2. Идентификация РЕОР (ЕРС-1) в культуре легочных фибробластов. Зависимость уровня экспрессии РЕОР от возраста клеточной культуры.
1.3. Идентификация РЕОР мыши (каспина - коллаген-связывающего серпина).
2. Особенности структуры РЕОР и кодирующего его гена.
2.1. Установление первичной структуры РЕОР человека и его кДНК.
2.2. Принадлежность РЕОР к семейству неингибиторных серпинов.
2.3. Наличие в РЕОР связи, высокочувствительной к действию сериновых протеиназ.
2.4. Асимметричное расположение положительных и отрицательных зарядов в молекуле РЕОР. Кристаллическая структура РЕОР.
2.5. Строение и свойства гена рей/человека.
2.6. Распространенность и эволюционная консервативность фактора РЕОР.
2.7. Рекомбинантный РЕОР.
3. Дифференцирующее действие РЕОР и его влияние на метаболизм.
3.1. Дифференцирующее действие РЕОР на эмбриональные ткани. Влияние РЕОР на метаболизм глиальных клеток.
3.2. Дифференцирующее действие РЕОР на опухолевые клетки.
3.3. Влияние РЕОР на накопление меланина и активность тирозиназы в клетках пигментного эпителия сетчатки глаза.
4. Нейропротекторное действие РЕОР.
4.1. Протекторное действие РЕОР на нейроны сетчатки глаза.
4.2. Протекторное действие РЕОР на гранулярные клетки мозжечка крыс.
4.3. Протекторное действие РЕОР на нейроны гиппокампа.
4.4. Протекторное действие РЕОР на двигательные нейроны спинного мозга.
5. Антиангиогенное действие РЕОР.
5.1. Корреляция уровня РЕОР и УЕОР с ангиогенезом в сетчатке. Влияние содержания кислорода в окружающей среде на экспрессию РЕОР.
5.2. Изменения уровня РЕОР при зрительных патологиях, связанных с избыточным ангиогенезом.
5.3. Возможные механизмы антиангиогенного действия РЕОБ.
6. Взаимосвязь между структурой и функциональными свойствами РЕОР. Идентификация рецептора РЕОР.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.
1. Идентификация гомологичных фрагментов молекул факторов НЬОР и РЕОР, отвечающих за их дифференцирующее действие на клетки НЬ-60 и эктодерму эмбрионов Хепория ¡аеугя на стадии ранней гаструлы.
1.1. Структурная гомология фрагментов молекул факторов НЬОР и РЕОР. Сравнительное изучение дифференцирующего действия факторов НЬОР и РЕОР на клетки линии НЬ-60.
1.2. Сравнительное изучение индукционного действия факторов НЬОР и РЕОР, а также пептидов НЬОР-6 и РЕОР-6 на эктодерму эмбрионов^ aeis.
2. Сравнительное изучение протекторного действия пептидов НЬОР-6 и РЕОБ-б на нейроны червя мозжечка крыс и клетки линии НЬ-60 при индуцированной химической гипоксии.
2.1. Протекторное действие пептидов на клетки червя мозжечка крыс. Восстановление под действием пептидов поведенческих реакций, нарушаемых при химической гипоксии червя мозжечка.
2.2. Влияние пептидов НЬОР-6 и РЕОР-6 на выживаемость клеток линии НЬ-60 при индуцируемой химической гипоксии.
3. Изучение молекулярных механизмов действия пептидов НЬВР-6 и РЕЭР-б на клетки линии НЬ-60.
3.1. Определение характера взаимодействия пептидов с клетками. Влияние пептидов на подвижность липидов в мембранных системах.
3.2. Влияние пептидов Н1ЛЗР-6 и РЕОР-б на активность аденилатциклазы в клетках линии НЬ-60 и выделенных клеточных мембранах.
3.3. Влияние пептидов НЫ)Р-6 и РЕЭР-б на активность фосфатидилинозитол-специфической фосфолипазы С.
4. Компьютерное моделирование пространственной структуры РЕОР. Регуляторная роль протеолиза связи
382Ь383Т в молекуле РЕЭР.
5. Роль фактора РЕОР в индукционном действии стекловидного тела глаза быка на эктодерму эмбрионов Хепорш aeis.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ (МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ).
1. Материалы.
1.1. Реактивы.
1.2. Сорбенты.
1.3. Протеолитические ферменты.
1.4. Факторы дифференцировки, антитела, клеточные линии.
1.5. Буферные растворы.
1.6. Растворы для индукции дифференцировки эмбрионов Хепорш 1аеч1з и гистологической обработки тканей.
2. Методы.
2.1. Культивирование клеток линии НЬ-60.
2.2. Определение дифференцирующей активности.
2.3. Исчерпывающий гидролиз белков смесью трипсина и а-химотрипсина.
2.4. Синтез пептидов.
2.5. Дополнительная хроматографическая очистка синтезированных пептидов.
2.6. Индукция дифференцировки эктодермы эмбрионов Хепорш aevis на стадии ранней гаструлы.
2.7. Гистологическая обработка дифференцированной эктодермы Хепорш 1аеУ1Я.
2.8. Содержание экспериментальных животных.
2.9. Изучение влияния пептидов на поведенческие реакции крыс, зависимые от функций червя мозжечка.
2.10. Определение количества гиперхромных клеток Пуркинье червя мозжечка крыс.
2.11. Определение количества жизнеспособных клеток HL-60 методом МТТ-теста.
2.12. Радиолигандный анализ.
2.13. Получение липосом, содержащих флуоресцентный зонд.
2.14. Изучение влияния пептидов на анизотропию поляризации флуоресценции зонда в липосомах.
2.15. Хроническая морфинизация клеток HL-60.
2.16. Выделение и солюбилизация мембран клеток HL-60.
2.17. Изучение влияния пептидов на активность аденилатциклазы в клетках HL-60 и препарате выделенных мембран клеток HL-60.
2.18. Определение количества цАМФ в пробах.
2.19. Определение внутриклеточной концентрации инозитолмоно- и дифосфатов в клетках линии HL-60.
2.20. Выделение стекловидного тела глаза быка.
2.21. Измерение концентрации белка методом Бредфорд.
2.22. Определение N-концевых аминокислотных последовательностей.
2.23. SDS-электрофорез белков в полиакриламидном геле.
2.24. Компьютерное моделирование пространственной структуры молекулы PEDF.
2.25. Статистическая обработка экспериментальных результатов.
ВЫВОДЫ.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.