Гут Р.Т. Морфогенетична мінливість та біохімічні механізми стійкості сосни звичайної у ценопопуляціях заходу України : Гут Р.Т. Морфогенетическая изменчивость и биохимические механизмы стойкости сосны обычной у ценопопуляциях мероприятия Украины

Краткое содержание

Сосна звичайна (Pinus sylvestris L.) є дуже лабільним видом, який росте в різних природно-кліматичних зонах із різницею критичних температур від -60^оС до +40 ^оС. Вона зростає на різних типах ґрунтів – від сухих і добре дренованих супіщаного механічного складу до перезволожених, кам'янистих та на вічній мерзлоті.

Сучасний ареал сосни звичайної займає обширну територію на Євроазійському континенті. Він остаточно сформувався в постльодовиковий період внаслідок поширення сосни із рефугіумів, які знаходились як на заході (в Європі), так і на сході (в Азії) (Вульф, 1944; Артюшенко, 1959, 1982; Безусько та ін., 1985; Удра, 1982, 1988; Broda et al., 1993) і налічує від 4 до 6 тис. років (Правдин, 1964). У періоди різких змін клімату та появи льодовикового покриву ареал сосни звичайної різко зменшувався і територіально розмежовувався (Санников и др., 2003). У постльодовиковий період сосна, як невибаглива до умов середовища деревна порода, одна із перших поширювалась на території, вільні від льодовикового покриву, з ділянок, що знаходились вздовж південної межі сучасного її ареалу. В процесі формування суцільного ареалу проходило переміщення генетичного матеріалу з різних відокремлених його частин. Територіальне розмежування ареалу сосни звичайної спостерігається і на сучасному етапі його формування. На формування популяцій сосни суттєво впливає також її фенологічне розмежування (Волосянчук,1995а, 1995б; Санніков, Петрова, 2003).

Матеріали з вивчення та розповсюдження сосни звичайної на території України висвітлено в багатьох роботах (Поварніцин, 1959; Шевченко, 1964; М'якушко, 1968, 1971; Смаглюк, 1972; Стойко, 1977; Молотков, 1981; Генсірук, 2002; Білоус, 2002, 2003; Яцик, 1977, 2007). Соснові ліси ростуть на площі 2241 тис.га, що становить 36 % вкритої лісом площі країни. На території України виділяють 9 географічно-кліматичних екотипів Pinus sylvestris L.: західно-поліський, малополіський, центральний, черкаський, східно-поліський, лівобережний, лісостеповий, сіверськодонецький, нижньодніпровський і кримський (Білоус, 2002). Сосна звичайна росте в різних природнокліматичних зонах і часто формує острівні масиви, які тривалий час функціонують ізольовано від суцільного ареалу сосни. Особливо вони характерні для південної межі ареалу сосни звичайної і гірських районів. Такі відокремлені соснові фітоценози є особливо цінними для проведення генетико-селекційних досліджень та вивчення впливу умов довкілля на процеси природного добору.

На сучасному етапі лісові насадження піддаються значному антропогенному впливу, який пов'язаний із постійним втручанням людини в закономірні процеси розвитку лісових фітоценозів. В умовах інтенсивного ведення лісового господарства відбувається збіднення генетичного різноманіття в природних популяціях сосни звичайної, які сформувались історично. В Україні практично не залишилось природних соснових фітоценозів. У зв’язку з цим необхідним є впровадження у лісове господарство популяційно-генетичного підходу, але це пов’язано з певними труднощами. Досі немає чітких критеріїв для визначення меж популяцій деревних рослин, особливо в районах суцільного ареалу. І.В. Петрова та С.М. Санніков (1996) межею природних популяцій пропонують брати більш-менш вузьку перехідну смугу території між ними, яка характеризується відносно швидким у порівнянні з сусідніми ділянками ареалу змінами тих або інших генотипних показників. Тобто необхідно проводити широкомасштабні генетичні дослідження, які б дозволили виявити межі популяцій. Л.Ф. Правдін (1964) запропонував виділяти об’єм популяції у межах типу лісу, а не в межах лісового масиву. Враховуючи наявність крилаток у насіння сосни, а також відстань розповсюдження пилку, окремі дослідники пропонують популяційні ареали поєднувати з лісорослинними районами і навіть провінціями (Мамаев, 1973). Отже, дослідження генетичної структури популяцій сосни звичайної з метою проведення заходів щодо збереження рослинного біорізноманіття та закріплення господарсько цінних ознак у популяціях є важливим науковим і практичним завданням.

ТЕОРЕТИКО-МЕТОДОЛОГІЧНІ ЗАСАДИ ВИВЧЕННЯ МІНЛИВОСТІ СОСНИ ЗВИЧАЙНОЇ ТА БІОЛОГІЧНОЇ СТІЙКОСТІ ЇЇ НАСАДЖЕНЬ

Генетична структура основних лісоутворюючих порід в Україні на даний час вивчена дуже слабо. Відсутні банки даних для ідентифікації генотипів у популяціях, на лісонасінних ділянках і клонових плантаціях, не складені генетичні карти плюсових та елітних дерев. Основною причиною цього є відсутність нових, простих і надійних методів отримання об’єктивної інформації про генетичну різноманітність деревних рослин (Алтухов и др., 1989; Dzialuk, 2005).

У зв’язку з цим вивчення генетичного різноманіття в популяціях деревних порід нерозривно пов’язано з вдосконаленням методів генетико-селекційних досліджень. У попередні десятиліття ряд дослідників для оцінки генотипів використовували морфолого-анатомічні показники (Правдин, 1964; Мамаев, 1973; Молотков и др., 1979; Яцык, 1981, 1989; Волосянчук, 1995; Видякин, Глотов, 1999; Санников, Петрова, 2003). Зокрема, у хвойних видів до уваги брали такі показники, як колір і форма лусок на шишках, як колір насіння і крилець, колір мікростробілів, морфолого-анатомічні показники хвої, кількість сім'ядолей у проростків тощо.

На сучасному етапі для вивчення генетичної структури популяції сосни та в селекційних цілях все ширше використовуються фізіологічно-біохімічні підходи. Вони базуються на вивченні вмісту пластидних пігментів у хвої, біосинтезу терпенових вуглеводнів і ферментів (Гришина, 1985; Гут, Криниький, 1989; Гончаренко и др., 1993; Криницький, 1993; Жиганов и др., 1995; Криницький, Гут, 1995; Петрова и др., 2000; Заїка, 2003; Санников и др., 2003, 2005, 2007; Коршиков и др., 2004, 2005).

В останні два десятиліття для вивчення генетичної структури популяцій деревних порід дослідники велику увагу приділяють дослідженню ізоферментних систем (Гончаренко и др., 1991; Шурхал и др., 1993; Prus-Głowacki and Stephan, 1994; Шиганов и др., 1995; Алтухов и др., 1996; Санников и др., 2002; Тихонова, 2003; Коршиков и др., 2004). Вважається, що цей підхід є більш надійним, оскільки ізоферменти синтезуються під прямим генетичним контролем, хоча їх визначення є не менш трудомістким процесом, ніж виявлення монотерпенових вуглеводнів.

Впровадження сучасних технологій із використанням ДНК-маркерів відкриває нові можливості в лісовій генетиці та селекції і є цілком необхідним для їх майбутнього розвитку, оскільки дозволить досліджувати між- та внутріпопуляційну генетичну мінливість і структуру, встановлювати філогенетичні зв’язки, вирішувати питання систематики, будувати відповідні генетичні та фізичні карти, визначати локалізацію генів у групах щеплення, клонувати їх, аналізувати еволюцію геномів, вивчати генетику популяцій та потік генів у них, аналізувати системи схрещування у природних та експериментальних популяціях (Календарь, Глазко, 2002; Глазко, 2003; Gribbon et al., 1999). Широко використовуються у популяційних генетичних дослідженнях лісових порід як кодомінантні ДНК-маркери: RFPL (Cheliak and Pitel, 1985; Dong and Wagner, 1993), STS (Joshi et al., 1999; Wang and Szmidt, 2001), мікросателітні SSR (Vendramin et al., 2001), так і домінантні ДНК-маркери: RAPD (Bowditch et al., 1993; Williams et al., 1993), SCAR (Martin et al., 1991), міжмікросателітні ISSR (Rakoczy-Trojanowska and Bolibok, 2004; Wolfe, 2005), REMAR (Hemmat et al., 1994), AFLP (Mueller and Wolfenbarger, 1999; Bussell et al., 2005; Mba and Tohme, 2005) та інші.

Слід відзначити, що у даний час створення нових технологій із застосуванням високоефективних регуляторів росту рослин також базується на знаннях про молекулярні механізми дії фітогормонів, вивченню яких присвячена низка фундаментальних досліджень (Лихолат, 1983; Ракитин, 1983; Полевой, 1984; Кефели, 1984, 1985, 1987; Меняйло, 1987; Терек, 1990). Результати цих теоретичних досліджень уже знайшли застосування в практиці сучасного рослинництва (Пономаренко, Черемха, 1997; Романюк та ін. 1997, 1998, 2002; Терек, Романюк, 1999; Єгупова, 2002; Яворовський, 2004; Гавриленко та ін., 2004). В останній час розроблено низку нових стимуляторів росту, які характеризуються високою ефективністю дії. Серед них широкого застосування набули агростимулін, бетастимулін, зеастимулін, івін, люцис, потейтин, емістим С, триман-1, трептолен, чаркор, гумат натрію тощо (Романюк та ін., 1997; Пономаренко, 1999). Їх рекомендують використовувати на різних етапах онтогенезу рослин – від пророщування насіння до вирощування культур (Родин, Попова, 1999; Романюк, 1999; Ведмідь, 2001; Борисова, 2002, 2005; Мусіяка, 2002; Романюк та ін. 2002; Гавриленко та ін., 2004; Угаров та ін., 2005).

Багато робіт присвячено також вивченню впливу біологічно активних речовин на проростання насіння і ріст сіянців деревних порід (Борисова, 2002; Попов, 2004; Ведмідь, Попов, 2004; Приседська, 2004; Угаров, 2005; Сірик та ін., 2006). Встановлено, що у хвойних рослин обробка насіння сприяла підвищенню його схожості (Ведмідь, 2001; Сірик та ін., 2006), збільшенню біометричних показників і маси сіянців (Родин, Попова, 1999; Приседська, 2004; Угаров, 2005; Вешицький та ін., 2006; Гут, 2008) та покращенню приживлюваності саджанців (Ведмідь, 2001). Водночас молекулярні механізми дії регуляторів росту на ріст та розвиток хвойних рослин ще не досліджено.

Важливим напрямком сучасних досліджень у лісівництві є підвищення біологічної стійкості лісотвірних деревних порід. У вирішенні цієї проблеми важливе місце посідають дослідження молекулярних чинників, які забезпечують стійкість рослин до фітозахворювань, зокрема рослинних дефензинів (Roberts and Selitrennikoff, 1986; Terras et al., 1993; Chagolla-Lopez et al., 1994; Broekaert et al., 1995; Osbo
et al., 1995; Broekaert et al., 1997; Patel et al., 1998; Segura et al., 1998; Gao et al., 2000; Fossdal et al., 2003). Однак у даний час дослідження молекулярних основ реагування рослин на біотичний стрес проводяться, в основному, на сільськогосподарських культурах, а механізми захисної відповіді хвойних порід на дію фітопатогенів є практично не вивченими. Тому вивчення біологічної активності дефензину сосни звичайної та його участі у формуванні стійкості хвойних порід до патогенних організмів є одним з пріоритетних завдань генетичних досліджень.

ОБ’ЄКТИ І МЕТОДИЧНІ АСПЕКТИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Для вивчення генетичної мінливості ценопопуляцій сосни звичайной за допомогою ДНК-маркерів та лісівничо-таксаційних показників відібрано насадження і закладено тимчасові пробні площі в різних геоморфологічних регіонах заходу України: Розточчя, Мале Полісся, Волинське Полісся (Шацьке поозер'я), Українські Карпати (Горгани) та НПП "Святі гори" (Донецький кряж), які суттєво відрізняються між собою за кліматичними показниками та ґрунтовими умовами. Загалом, об'єктами досліджень слугували різного віку насадження сосни звичайної природного і штучного походження, які сформувались у різних лісорослинних районах під впливом різних екологічних факторів. У генетичних і дендрохронологічних дослідженнях використано 460 дерев сосни віком 50–130 років, які відібрано в 17 ценопопуляціях. Найбільш детальні лісівничо-таксаційні, дендрохронологічні та генетичні дослідження проводили в плюсових насадженнях ДП "Буське лісове господарство", ДП "Радехівське лісомисливське господарство" та нормальному насадженні Страдчівського навчально-виробничого лісокомбінату.

Для лісівничо-таксаційної характеристики соснових насаджень і вивчення морфогенетичної мінливості та біохімічних механізмів стійкості сосни звичайної у ценопопуляціях нами використано чотири групи методів досліджень: морфометричні, фізіолого-біохімічні, молекулярно-генетичні та генно-інженерні.

Закладання пробних площ у відібраних соснових насадженнях проводили за загальноприйнятою методикою (Анучин, 1982; ОСТ 56-69-83, 1984). Таксаційні показники деревостанів визначали за діючими нормативно-довідковими матеріалами (Никитин и др., 1984; Швиденко, Строчинський и др., 1987). Для визначення висоти, протяжності крони, висоти підняття грубої кори використовували лазерний висотомір (гіпсометр) "Vertex II" (CSP Outdoors). Радіальний приріст дерев вивчали на висоті 1,3 м шляхом відбору кернів віковим буравом Преслера по двох супротивних радіусах (Колищук, 1967). Ширину річних кілець вимірювали на півавтоматичній установці для дендрохронологічних досліджень фірми "Zeiss" із автоматичною реєстрацією даних. Отримані дендрохронологічні ряди синхронізовували з календарними роками утворення кожного річного приросту (кільця) за програмою COFECHA. Індексацію дендрошкал проведено за допомогою програми ARSTRAN. Для опису подібності річних кілець різних моделей використовували коефіцієнт подібності -мінливості (Карпавичюс, 1981).

Вивчення впливу різних стимуляторів на ріст і розвиток сіянців сосни звичайної проводили в поліетиленовій теплиці літнього типу і на відкритому ґрунті з вирівняним агрофоном. У дослідженнях використовували гетероауксин (200 мг/мл), гіберсіб (200 мг/мл), α-нафтилоцтову кислоту (100-500 мг/мл ), гумат натрію (10 г/мл), триман-1 (концентрація 0,01%), агростимулін (0,1%), емістим С (0,1-0,2 %), івін (0,1%), зеастимулін (0,1%), біостимулін (1-2%) та розчин KNO₃ (0,1-1%), Поряд із цим дію ростових речовин вивчали в поєднанні з плівкоутворюючими розчинами фодексу (1 і 5%) і сахарози (1%) та речовинами-проникниками - поліетиленгліколем-6000 (1%) і полівінілпіролідоном K-25 (1%). В кінці вегетаційного періоду із кожного варіанту досліду відбирали по 50 середніх за величиною сіянців та визначали їх висоту, довжину головного кореня, діаметр кореневої шийки, довжину хвоїнок та фітомасу хвої, пагонів і кореневих систем.

Вміст пластидних пігментів визначили за загальноприйнятими методиками (Починок, 1980; Казаков, 2000).

Для вивчення спектру білків проростків сосни звичайної насіння 1 класу пророщували в стерильних умовах на фільтрувальному папері, змоченому дистильованою водою, при температури 26 °С в чашках Петрі, герметично закритих парафіном. Проростки та ендосперм виділяли на 1, 3, 5, 7 добу проростання, заморожували у рідкому азоті та зберігали при -70 ⁰С до їхнього використання.

Для виділення та очистки дефензину з проростків сосни звичайної застосовували стандартні методики препаративної біохімії: осадження білків сульфатом амонію, центрифугування, іонообмінну хроматографію. Концентрацію білка в клітинних лізатах та в очищених препаратах білків визначали колориметричним методом із використанням Coomassie Protein Reagent («Pierce»).

Гомогенність і чистоту отриманих білкових препаратів аналізували електрофоретичним розділенням у 5-22% ДСН-ПААГ у системі Леммлі (1970) або в трис-трициновій буферній системі (Schägger and Jagow, 1987). Після електрофорезу гелі забарвлювали діамантовим синім Coomassie G-250 або азотнокислим сріблом за модифікованою методикою A. Shevchenko (1996).

Антимікробні властивості дефензину досліджували щодо фітопатогенних грибів родів Botrytis, Fusarium, Alte
aria, які отримано з Інституту мікробіології та вірусології НАН України, за стандартними методиками (Broekaert et al., 1990).

Виділення сумарної ДНК із свіжих зразків хвої проводили модифікованим СТАБ-методом Дж. Дойла (1987, 1990), тотальної РНК із свіжозаморожених у рідкому азоті коренів семиденних проростків сосни – модифікованим методом літієво-хлоридної преципітації (Chang, 1993). Якість отриманої сумарної РНК перевіряли електрофоретичним і спектрофотометричним методами. Полі(A)+РНК очищали афінною хроматографією на оligo(dT)₂₅ носії Dynabeads (“Dynal”). Конструювання бібліотеки кДНК сосни звичайної проводили з використанням наборів Zap Express cDNA Synthesis Kit та Zap Express cDNA Gigapack III Gold Cloning Kit (“Stratagene”, США).

Полімеразно-ланцюгову реакцію проводили в ампліфікаторі «Proteus» («Helena BioSciences», Велика Британія) із використанням реактивів виробництва «Fermentas» (Литва) у такому режимі: 94 °С, 3 хв.; 30 циклів [94 °C, 1 хв.; 60 °С, 1  хв.; 72 °С, 1 хв.] і після останнього циклу 5 хв. при 72 °С.

Генно-інженерні експерименти (виділення плазмідної ДНК, електрофорез ДНК в агарозному гелі, елюцію фрагментів ДНК із гелю, гідроліз ДНК рестриктазами, лігування ДНК, клонування гена, отримання компетентних клітин, трансформацію бактерій) проводили за стандартними методиками (Маниатис, 1984).

Мас-спектрометричний аналіз пептидів проводили на мас-спектрометрі Q-TOF I („Micromass”, Велика Британія). Секвенування нуклеотидних послідовностей рекомбінантних конструкцій здійснювали за допомогою автоматичного ДНК секвенатора ABI 73^TM (“Applied Biosystems”, Велика Британія) у Лондонському університеті.

Рекомбінантний дефензин сосни (рекPsDef1) отримано шляхом експресії його кДНК в бактеріальній системі Escherichia сoli штаму BL21(DE3) та очистки афінною хроматографією на глутатіон-сефарозі. Очищений препарат рекPsDef1 використовували для імунізації кролів для отримання поліклональних антитіл. Титр антитіл визначали твердофазним імуноензимним та імунодот-блот аналізом.

Експресію гена PsDef1 на рівні білка у тканинах проростків сосни визначали методом імуноблотингу з використанням отриманих нами специфічних поліклональних антитіл. Імунореактивні білки виявляли за реакцією посиленої хемілюмінесценції (“Amersham”, Велика Британія).

Cтатистичну обробку даних та побудову графіків здійснювали за допомогою програм Statistica 7.0 та Excel 2003 відповідно до загальноприйнятих алгоритмів. Для аналізу гомології ДНК та білків використовували електронну службу BLAST 2.0 Національного центру біотехнологічної інформації США.

МОРФОМЕТРИЧНА ХАРАКТЕРИСТИКА МАТЕРИНСЬКИХ ДЕРЕВ ТА ПІВСІБСОВОГО ПОТОМСТВА СОСНИ ЗВИЧАЙНОЇ

Для проведення морфометричних і генетичних досліджень у дослідних ценопопуляціях відбирали по 30 модельних дерев сосни звичайної, які представляли різні селекційні категорії – плюсову, нормальну і мінусову.

Середня висота плюсових дерев буської ценопопуляції становила 37,7 м, середній діаметр − 61,5 см і середній об'єм стовбурної деревини одного дерева − 4,77 м³. У плюсових дерев лопатинської ценопопуляції ці показники відповідно становили 38,7 м, 57,6 см і 4,29 м³, а в страдчівської – 31,2 м, 53,3 см і 3,03 м³. Необхідно відмітити, що у межах селекційних категорій модельні дерева характеризуються значною індивідуальною мінливістю за біометричними показниками.

Однією із селекційних характеристик дерев є біометричні показники крони. В плюсових дерев буської ценопопуляції середня протяжність крони становить 15,4 м, відносна її довжина 40,8 %, а діаметр 7,5 м. В нормальних дерев буської ценопопуляції ці показники відповідно становили 10,2 м, 29,5 % і 5,2 м, а в мінусових – 8,1 м, 25,0 % і 4,3 м. У плюсових дерев сосни лопатинської протяжність крони становить 11,8 м, відносна її довжина − 30,4 % і діаметр − 7,4 м. В лопатинській ценопопуляції, на відміну від дерев буської, нормальні дерева, в цілому, розвивають більші крони, ніж плюсові. В нормальних дерев страдчівської ценопопуляції, порівняно з плюсовими і мінусовими, протяжність крони виявилась найбільшою. Вона становить 10,3 м, що дорівнює 33,1 % висоти дерева. В плюсових дерев цей показник становить 8,4 м (27,0 %), а мінусових – 8,5 м (30,8 %). Діаметр крони закономірно зменшується від плюсових (8,3 м) до мінусових (5,3 м) дерев.

Розвиток грубої кори характеризує певні генетико-селекційні ознаки. В плюсових дерев буської ценопопуляції вона формується до висоти 15,4 м, в нормальних – до 14,8 м, а в мінусових – до 14,1 м. В страдчівській ценопопуляції плюсові дерева характеризуються найвищим підняттям грубої кори (17,2 м), а нормальні – найнижчим (12,6 м).

Відібрані на основі аналізу морфометричних показників та просторового розміщення по площі модельні дерева різних селекційних категорій повною мірою представляли генофонд буської, лопатинської і страдчівської ценопопуляцій сосни звичайної у проведених нами генетичних дослідженнях.

Ріст півсібсових потомств сосни звичайної. Встановлено, що родини буської ценопопуляції, вирощені з насіння репродукції 1981 року, в 22-річному віці досягли висоти 13,4–14,6 м, діаметра 14,3–15,1 см і запасу стовбурової деревини 194–460 м³/га, при густоті зростання 1407–3229 шт./га. Висота 21-річних потомств репродукції 1982 року коливається в межах 13,3–14,4 м, діаметр – 14,2–18,3 см, запас стовбурової деревини – 165–346 м³/га і густота – 1175–3040 шт./га. Найбільшою диференціацією за лісівничо-таксаційними показниками відзначаються наймолодші 20-річні потомства, вирощені з насіння репродукції 1983 року. Вони досягли висоти 11,4–13,8 м, діаметра – 11,6–14,9 см, запасу – 209–386 м³/га і зростають при густоті – 2311–4114 шт./га.

Серед цих потомств високу інтенсивність росту, протягом усього періоду спостереження виявлено в деяких родин як плюсових (+1, 58/10), нормальних (3Н, 4Н, 6Н), так і мінусових (-1, -3) дерев. За висотою вони перевищують показники контрольного варіанту на 6,9–19,0 % за діаметром − на 5,5–17,3 %, за запасом стовбурної деревини − на 10,9–27,8 %. Окремі родини (55/7, 64/8^a) з часом покращили інтенсивність росту, а інші значно погіршили (85/21, -4)

У 20-річних потомств страдчівської ценопопуляції середня висота становила 12,1–13,7 м, діаметр – 13,2–14,5 см і запас деревини 270–428 м³/га. Родини переважно плюсових дерев (+1, +2, +3, +4, +5) і окремих мінусових (-7) виділяються високою інтенсивністю росту. За висотою вони перевищують контроль на 4,0–8,7 %. Встановлено значне зниження інтенсивності росту в останній період у родини модельного дерева -6.

Отже, високою енергією росту і продуктивністю характеризуються потомства не тільки плюсових, але і нормальних та мінусових дерев. Основні закономірності росту цих потомств, які спостерігались на початковому етапі формування (до 8–10 років) збереглись і при досягненні ними 20–22-річного віку.

Дендрохронологічні дослідження материнських деревостанів. Ріст дерев в ценопопуляціях зумовлений з одного боку впливом зовнішніх (мікрокліматичних, грунтово-гідрологічних та ін.) факторів, а з іншого – генетичними особливостями. Величина річного приросту значною мірою залежить від реакції генотипу на річні коливання кількості опадів і тепла, їх розподілу протягом року. Середнє значення радіального приросту в плюсових дерев буської ценопопуляції становить 1,74-2,58 мм, в нормальних – 1,20-1,94 мм і в мінусових – 0,68-1,64 мм. У плюсових дерев лопатинської ценопопуляції ці показники становили 1,64-3,23 мм, а у нормальних − 1,47-3,19 мм. У плюсових дерев страдчівської ценопопуляції середній радіальний приріст виявився на рівні 1,83-2,76 мм, в нормальних – 1,68-3,42 мм і в мінусових – 1,12-1,88 мм .

Аналіз динаміки радіального приросту дерев буської ценопопуляції показує, що в першій половині онтогенезу (до 1960 року) у переважної кількості дерев величина радіального приросту залишилась на високому рівні. Починаючи з 1960 року, у них спостерігався значний спад інтенсивності ростових процесів. Однак в окремих дерев (57/9, 64/8, 84/20, 5Н) підвищена ростова активність продовжувалась у 1970-1980 роки. В плюсових дерев 53/5, 54/6, 55/7, 57/9, 58/10, 60/12, 82/18, 83/19, 84/20, 85/21, в нормальних – 5Н, 13Н і мінусового – -12 відзначається різке збільшення радіального приросту в останній період (2000-2004 роки). У більшості плюсових і нормальних дерев лопатинської ценопопуляції зниження інтенсивності радіального приросту також почалось у період з 1960 по 1969 роки, хоча окремі дерева продовжували інтенсивно рости і в період з 1970 по 1979 рік. У дерев 8/9, 30/40, 3Н висока інтенсивність ростових процесів спостерігається впродовж усього періоду спостереження. Аналогічні тенденції у ростових процесах спостерігаються і в дерев страдчівської ценопопуляції. Отже, окремі модельні дерева характеризуються високою ростовою активністю камбію протягом всього періоду росту. Високими показниками росту за діаметром відзначаються не тільки плюсові, а і деякі нормальні дерева, Це вказує на їх високий генетичний потенціал, який в конкретних умовах середовища не реалізувався повною мірою за весь період росту.

Для характеристики особливостей росту за діаметром протягом 1925 по 2004 роки використано відносні показники приросту (індекси). Дослідження показало, що усереднені індекси по 20-річних періодах у дерев змінюються слабо. Їх показники дерев різних селекційних категорій в ценопопуляціях становили 0,86-1,34. Найменшою мінливістю індексів приросту характеризуються дерева страдчівської ценопопуляції (0,89-1,120), а найбільшою – буської ценопопуляції (0,89-1,34). Відмінностей між динамікою індексів приросту дерев різних селекційних категорій росту не виявлено.

Коефіцієнти подібності дендрорядів дерев в ценопопуляціях виявились, як правило, високими і середніми. Низьких показників подібності дендрорядів (менше 50 %) між деревами досліджуваних ценопопуляцій не виявлено. Це вказує на їх однотипний характер росту в даних умовах.

Для виявлення індивідуальної реакції окремих дерев на коливання мікрокліматичних показників визначено коефіцієнт чутливості в дерев різних селекційних категорій. У плюсових дерев буської ценопопуляції його значення становило 0,258-0,419, у нормальних – 0,287-0,503 і мінусових – 0,314-0,412. У дерев лопатинської ценопопуляції показники коефіцієнтів чутливості, відповідно, становили 0,192-0,427, 0,304-0,547 і в страдчівської – 0,309-0,312, 0,239-0,359 і 0,267-0,393. Отже, у переважної кількості дерев коефіцієнт чутливості виявився середнім і знаходиться в межах 0,2-0,4. Прослідковується тенденція до його збільшення в нормальних і мінусових дерев, особливо в буській і лопатинській ценопопуляціях.

Результати дослідження кореляційного зв'язку між середніми індексами ширини річних кілець модельних дерев і середньомісячною температурою за 20-річні періоди показали, що коефіцієнти кореляції характеризуються, як правило, слабкими і помірними значеннями. Найбільш високою тіснота зв'язку індексів приросту виявилась з температурою березня (0,399-0,711). Зв'язок індексів радіальних приростів із кількістю опадів виявився ще нижчим, ніж з температурою, оскільки опади в даному регіоні досліджень не носять лімітуючого характеру.

Індивідуальна мінливість дерев сосни різних селекційних категорій за реакцією радіального приросту на зміну температури і кількості опадів виявилась слабкою. Отже, основні мікрокліматичні показники в районі Малого Полісся і Львівського Розточчя не лімітують ріст дерев сосни звичайної за діаметром протягом всього періоду онтогенезу. Очевидно їх диференціація за діаметром викликана більшою мірою спадковими факторами.

ГЕНЕТИЧНА МІНЛИВІСТЬ ТА ДИФЕРЕНЦІАЦІЯ ЦЕНОПОПУЛЯЦІЙ СОСНИ ЗВИЧАЙНОЇ

Величина та розподіл генетичної мінливості всередині виду є надзвичайно важливими для його еволюційного потенціалу. Загалом вони визначають шанси на виживання виду. Тому оцінка і дослідження генетичної мінливості є ключовим питанням у розробці ефективних стратегій збереження видів та виявлення тактики відбору дерев із спадково закріпленими господарсько цінними властивостями.

Встановлення генетичної структури в ценопопуляціях сосни звичайної за допомогою хлоропластних мікросателітів. Для встановлення генетичної структури гірських і рівнинних ценопопуляцій сосни, поширеності гаплотипів та визначення рівня диференціації соснових ценопопуляцій використано десять мікросателітних послідовностей ДНК хлоропластів: Pt26081, Pt36480, Pt45002, Pt30204, Pt71936, Pt15169, а також PCP87314, PCP41131, PCP102652, PCP1289, які були проаналізовані з використанням удосконаленого протоколу ПЛР (Dzialuk, Burczyk, 2005).

Гірські ценопопуляції. Проаналізовано генетичну структуру 10 ценопопуляцій реліктової сосни звичайної, зростаючої в Карпатах і за місцем розташування (гірські вершини, болота) поіменованих як: "Високий Камінь", "Клива", "Лютошари", "Мшана", "Турова дача", "Сокіл", "Ширковець", "Осій", "Джурджі", "Піги". За результатами аналізу у десяти локусах хлоропластної ДНК 283-ох дерев сосни різних ценопопуляцій виявлено 52 алелі. Для кожного локусу було встановлено від 3 (PCP102652) до 8 (Pt15169) алелей. Аналіз частоти алелей в локусах вказує на значну мінливість дерев у ценопопуляціях. Найбільшою частотою у деревах переважної кількості ценопопуляцій характеризуються алелі 107, 143, 170, 105, 112, 136 і 114 (0,667-1,00). Також виявлено мономорфні локуси у наступних ценопопуляціях: "Клива" і "Лютошари" (Pt36480), "Мшана" (Pt45002), "Високий Камінь", "Осій", "Джурджі" і "Піги" (PCP41131). В окремих ценопопуляціях частота алелей виявилась низькою. Так, частота алелі 107 (Pt26081) у дерев ценопопуляції "Джурджі" становить 0,267, тоді коли в інших ценопопуляціях 0,667-0,933. Загалом за частотою найбільш поширених алелей ценопопуляції "Осій" (Pt71936), "Ширковець" (Pt15169) і "Сокіл" (Pt30204) найбільшою мірою відрізняються від інших ценопопуляцій. Слід відзначити, що велика кількість алелей: 105, (Pt26081), 144, 145, 146 (Pt36480), 166, 168, 174 (Pt45002), 111, 114 (PCP87314), 130, 135 (PCP41131), 148 (Pt71936), 113, 115 (PCP102652), 146 (Pt30204) трапляються тільки в дерев окремих ценопопуляцій, як правило, з низькою частотою (0,033-0,067). Це свідчить про проходження в цих ценопопуляціях природного відбору дерев певного генотипу.

Всього у 10 ценопопуляціях виявлено 105 унікальних гаплотипів або 80,2 % від їх загальної кількості – 131. У ценопопуляції "Високій камінь" їх виявилось всього 4 у 4 дерев. Порівняно невеликою кількістю унікальних гаплотипів (6-9) характеризуються ценопопуляції "Мшана", "Лютошари", "Клива" і "Джурджі". Спільних гаплотипів для двох ценопопуляцій нами відзначено лише 18 у 54 дерев сосни звичайної реліктової. Найбільше спільних гаплотипів для двох ценопопуляцій виявлено в ценопопуляціях "Високий Камінь" (5), "Турова дача" (5) і "Ширковець" (5), а найменше в ценопопуляції "Джурджі" (2). Спільних гаплотипів для трьох і більше ценопопуляцій виявлено вісім. Серед них найбільш представленим є гаплотип Н3, який трапляється в 14 дерев шести ценопопуляцій. Більшість інших гаплотипів (Н10, Н24, Н32, Н51, Н82, Н91) трапляються у трьох ценопопуляціях 4-23 дерева, а гаплотип Н12 виявлено в 7 дерев чотирьох ценопопуляцій.

Отже, в досліджуваних ценопопуляціях сосни Карпат виявлено від 11 до 25 гаплотипів при середньому значенні 17,1. Найбільш високою гаплотипною мінливістю характеризуються ценопопуляції "Турова дача", "Сокіл", "Ширковець", "Осій" і "Піги" (19-25 гаплотипів). В інших ценопопуляціях трапляється тільки 11-14 гаплотипів. Аналогічним чином змінюється в ценопопуляціях ефективне число гаплотипів, яке коливається від 5,29 ("Мшана") до 20,46  ("Турова дача"). Чіткого кореляційного зв’язку між кількістю гаплотипів і знаходженням ценопопуляцій сосни над рівнем моря не виявлено.

Внутріценопопуляційна гаплотипна різноманітність є високою у всіх ценопопуляціях (Н_е=0,839-0,984). Водночас розподіл генетичної мінливості поміж ценопопуляціями, отриманої за допомогою аналізу AMOVA, показав, що відсоток генетичної мінливості, спричиненої відмінностями між ценопопуляціями, є низьким, але доволі істотним (F_st=0.07, P=0.001). Більшою мірою генетична мінливість проявлялась в межах однієї ценопопуляції, що є характерною ознакою внутріценопопуляційної різноманітності. Середня відстань між індивідуумами ценопопуляцій згідно з SMM складала 3,65. У ценопопуляціях вона коливається в межах 2,46-5,07. Середнє значення генетичної різноманітності всередині окремої ценопопуляції, отримане нами, є одним із найвищих для сосни звичайної.