ЕКОЛОГІЧНО БЕЗПЕЧНЕ ОДЕРЖАННЯ ХІТИНВМІСНИХ СПОЛУК ІЗ МІЦЕЛІАЛЬНИХ ВІДХОДІВ БІОТЕХНОЛОГІЧНОГО ВИРОБНИЦТВА ЛИМОННОЇ КИСЛОТИ

Краткое содержание

У вступі охарактеризовано сучасний стан досліджуваної проблеми, обґрунтовано актуальність обраної теми, мету і задачі дослідження, розкрито наукову новизну і практичне значення отриманих результатів, наведено конкретні наукові результати, а також дані з впровадження, апробації і публікації основних результатів.

У першому розділі проведено аналіз літератури з питань вилучення хітину, хітозану та хітинвмісних продуктів з різної сировини (панцирів ракоподібних, комах, грибів). Проаналізовані переваги та недоліки існуючих методів одержання хітин- та хітозанвмісних комплексів з грибів. Зроблено висновок стосовно доцільності застосування хітинвмісних продуктів у різних галузях народного господарства. Аналіз літератури показав, що хітинвмісні комплекси, які є аналогом целюлози, після насичення важкими металами та барвниками можна рекомендувати до утилізації шляхом застосування в силікатній промисловості як пігменти та наповнювачі.

            У другому розділі описані вихідні речовини, матеріали та методи експерименту. В роботі використовували біомасу міцеліального гриба Aspergillus niger, яка є відходом біотехнологічного виробництва лимонної кислоти.

Зразки біомаси відбирали після закінченого циклу ферментації з різних ферментаторів та для них визначали: вологість, зольність та рН водної витяжки за стандартними методиками; вміст хітинвмісних комплексів - за масою сухого залишку після відділення супроводжуючих речовин (розчинні неорганічні солі, білки, ліпіди, лужнорозчинні глюкани та вуглеводи) ретельною промивкою водою з додаванням 2% розчину лугу.

Хітинвмісні комплекси (ХВК) одержували з міцеліальних відходів гриба Aspergillus niger за розробленим способом (див. нижче), а хітозанвмісні комплекси (ХанВК) отримували за наведеними методиками:

·         методикою Муззареллі, яка включає обробку вихідної сировини 40% водним розчином NaOH впродовж чотирьох годин при температурі 118 ^оС [Muzzarelli, 1977];

·         методикою Феофілової - обробка 20% NaOH впродовж однієї години при температурі 110 ^оС [Феофілова та ін., 1997].

Одержані комплекси аналізували на вміст:

 - вуглецю та водню за мікрометодом Прегля, який ґрунтується на спалюванні зразка та поглинанні Н₂О та СО₂;

 - азоту за методом Дюма;

 - хітину, який розраховували за кількістю азоту, що входить до складу комплексів;

 - глюканів, визначення яких проводили за методикою утворення кольорової реакції глюкози з антроном з кількісною оцінкою колориметричним методом;

 - меланінів - екстракцією 1н KOH з подальшим осадженням 1н HCl;

 - хітозану при використанні методики Уайта, яка ґрунтується на визначенні маси хітозану ваговим методом, після екстракції 2% водним розчином оцтової кислоти та осаджування хітозану розчином лугу [White et.al., 1979].

Також для одержаних комплексів визначали:

 - ступінь деацетилювання (СД), виходячи з масового вмісту хітину та хітозану в комплексах;

 - вологість, зольність, рН водяної витяжки - за стандартними методами [Cмирнов, 1982];

 - ступінь набухання - при замочуванні 4 г зразка в дистильованій воді на добу з фіксацією початкового та кінцевого об’ємів;

 - водоутримуючу здатність (ВУЗ) - за різницями мас зразка, 2 г якого промочували водою впродовж 20 годин, а потім відфільтровували та висушували до постійної маси при 105 ^оС.

ІЧ спектроскопічне дослідження комплексів проводили на спектрофотометрі “Specord IR-75”.

Дослідження волокнистої структури комплексів проводили електронно-мікроскопічним методом на растровому електронному мікроскопі типу РЭМ-100У.

      При вивченні сорбційних властивостей комплексів були досліджені такі сорбційні процеси:

      1. Сорбція іонів міді, цинку, хрому, кадмію, свинцю в статичних та динамічних умовах. Розчини заданої концентрації були приготовлені відповідно до стандартних методик [Лазарев, 1976]. Аналіз розчинів на вміст металів проводили атомно-адсорбційним методом на спектрофотометрі типу  С-115-М1 (виробник АТ “CEЛМІ”, м. Суми, Україна).

      2. Сорбція барвників (прямого блакитного К, прямого коричневого 2КХ, кислотного чорного С, кислотного червоного 2С, активного яскраво-блакитного 2 КТ) в статичних та динамічних умовах. Концентрацію барвників у розчинах визначали на фотоколориметрі ФЕК-М.

      3. Сорбція нафтопродуктів в статичних, динамічних умовах та з водної поверхні. Емульсії нафти готувались при механічному диспергуванні нафти в дистильованій воді. Концентрацію вуглеводнів нафти у водних розчинах до та після сорбції визначали за ІЧ спектром екстракту ССl₄ на спектрофотометрі ИКС-29.У4.1 (Ленінград “ЛОМО”).

Третій розділ присвячений представленню результатів дослідження впливу режиму лужної обробки біомаси на кількісний вихід та фізико-хімічні властивості комплексів. Для розв’язку однієї з основних задач роботи – дослідження сорбційних властивостей комплексів - необхідно було, в першу чергу, розробити спосіб одержання хітинвмісного волокнистого фільтруючого матеріалу, який забезпечив би можливість: а) здійснювати швидку та ефективну переробку міцеліальних відходів, які довго не зберігаються; б) використовувати недороге технологічне обладнання; в) використовувати реактиви низької концентрації; г) розташовувати виробництво на базі вже діючих.

На першому етапі розробки способу одержання було проведено дослідження міцеліальних відходів гриба Aspergillus niger, які залишаються в процесі біотехнологічного виробництва лимонної кислоти на Смілянському цукровому комбінаті. Встановлено, що для біомас, відібраних з ферментаторів, в яких чітко дотримувались технології глибинної ферментації, вміст хітину у вигляді хітинвмісних комплексів становить близько 40%. Більш високий вміст (43%) характерний для біомас, які одержані при порушенні технологічного режиму (недостатня аерація, низька температура та якість вихідної меляси). Отримані дані добре погоджуються з результатами інших вчених для біомас, які були вирощені в лабораторних умовах [Немцев, 1999]. Збільшення кількості хітину можна розцінювати як своєрідну реакцію гриба на несприятливий вплив зовнішніх умов та захист клітини від їх дії за допомогою цього стійкого комплексу біополімерів. Зразки біомаси характеризуються такими параметрами: зольність 8-10,5%, вологість 70-75%, вміст жирів 1,62-2,35%, білків 14,4-18,7%, вміст супроводжуючих органічних речовин (лужнорозчинні глюкани та вуглеводи) 37,2-43,6%.

При застосуванні методики ПФЕ-2³ було побудовано математичну модель у вигляді лінійного полінома, що апроксимує залежність виходу ХВК від характеристик режиму лужної обробки відходів міцелію гриба Aspergillus niger.

Запропонований спосіб одержання хітинвмісних комплексів складається з таких етапів:

      Перший етап - обробка 100 г біомаси дистильованою водою в співвідношенні 1:10 з метою відмивки міцелію від розчинних солей та домішок, з подальшим перемішуванням впродовж 10 хвилин з 0,1 н розчином HCl, взятим у об’ємі одного літру, для вилучення нерозчинних солей.

      Другий етап – обробка промитої та відфільтрованої біомаси 2% водним розчином NaOH об’ємом 1 літр при температурі 60 ^оС впродовж 30 хвилин при перемішуванні для вилучення білків і ліпідів, що містяться у цитоплазмі міцеліальних клітин.

      Третій етап – з метою очищення від домішок та відбілювання продукту ретельна промивка відфільтрованої біомаси водою з додаванням 200 мл 0,003 М розчину NaClO на кожний літр води.

      Четвертий етап - промивка продукту дистильованою водою з додаванням 0,1 н розчину HCl для нейтралізації до рН = 7. Сушіння продукту при температурі 25-30 ^оС до постійної маси. Вихід ХВК становить 42±0,5% в перерахунку на сухий вихідний міцелій.

      Показано, що використання для обробки міцеліальних відходів хімічних реагентів низької концентрації дає змогу зменшити кількість і концентрацію стічних вод практично на 70% порівняно з відомими методиками, а об’єднання стічних вод після першого та другого етапів сприяє їх нейтралізації та зниженню негативного впливу на навколишнє середовище.

      За даними елементного аналізу було визначено хімічний склад комплексів та встановлено, що запатентований спосіб дозволяє одержувати комплекси зі стабільним складом при використанні різної за якістю біомаси, а також завдяки застосуванню для обробки низькоконцентрованих розчинів хімічних реагентів в складі комплексів крім хітину і глюканів (30,8-31,2%; 65,1-66,0% відповідно) зберігається 1,9-2,3% меланінів та 1,0-1,3% білків.

При розробці способу одержання хітинвмісних комплексів з міцеліальних відходів електронно-мікроскопічним методом проведена оцінка впливу умов лужної обробки на морфологічну структуру комплексів. Встановлено, що при використанні розчинів лугу концентрацією 1 та 2% комплекси характеризуються волокнистою морфологічною структурою з параметрами волокон: довжина 0,8-1,0 мм та середній діаметр 6 мкм. Підвищення концентрації лугу до 6% призводить до утворення зернистої структури у вигляді агрегатованих глобул, що додатково підтверджує доцільність використання для обробки сировини низькоконцентрованих розчинів лугів.

Отримані комплекси були охарактеризовані методом ІЧ спектроскопії. У спектрі хітинвмісних комплексів в області 1500-1700 см^-1 проявляються інтенсивні смуги поглинання, характерні для хітину з максимумами 1540 см^-1 (амід ІІ), 1640 та 1620 см^-1 (амід І). При порівнянні хітинвмісних комплексів, одержаних з використанням розчинів лугу концентрацією 1, 2 та 6%, встановлено, що в ІЧ спектрах зразків спостерігається зменшення інтенсивності та напівширини смуги С-Н валентних коливань в області 2920 см^-1 з підвищенням концентрації лужних розчинів. Даний факт, на нашу думку, є наслідком збільшення упорядкованості та зменшення розгалуження молекул полісахаридів. Збільшення розгалуження молекул приводить до додаткового утворення водневих зв’язків з різними енергіями, що зумовлює додаткове збільшення ширини смуги.

            У четвертому розділі наведені результати дослідження процесу сорбції іонів важких металів з водних розчинів на хітин- та хітозанвмісних комплексах. Фізико-хімічні характеристики досліджуваних зразків наведені в табл. 1.

Мета даних експериментів полягала в дослідженні та порівнянні ефективності сорбції іонів важких металів на комплексах з різним значенням ступеня деацетилювання – хітинвмісних (СД = 0,8%) та хітозанвмісних (СД = 63 та 96%). Як було встановлено Муззареллі, важливою властивістю хітину та хітозану є їх здатність утворювати хелатні комплекси з іонами важких металів. В дисертаційній роботі для підтвердження наявності хелатних комплексів методом молекулярної механіки ММ+ при застосуванні програми HyperChem проведено моделювання та розрахунок комплексів. Моделювання процесу комплексоутворення проводилось за участю різних атомів кисню та азоту з двох тримономерних ланцюгів хітину, молекули води та іону свинцю.