| Краткое содержание: | В огляді літератури представлено сучасні дані щодо структури та властивостей молекули плазміногену, детально представлено інформацію щодо процесу активації проферменту. Представлено дані щодо компонентів системи фібринолізу, які виконують роль активаторів плазміногену за фізіологічних умов і некаталітичних індукторів каталітичної активності екзогенного походження.
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
У роботі було використано такі матерали та реактиви: трис(гідроксиметил)амінометан, хромогенний субстрат плазміну S-2251 (H-D-Лей-pNa), a-казеїн, диізопропілфторфосфат (DFP, ДФФ) (“Merck”, Німеччина), п-нітрофеніловий ефір гуанідинбензойної кислоти (p-NFGB) (“Sigma”, США); стрептокіназа Kabikinase (“Pharmacia AG”, Швеція), Cibacron Blue-Sepharose, Sepharose CL 4B, Sephacryl S-200, Superose 12 HR, протеїн А-Sepharose (“Pharmacia”, Швеція; “Amersham Pharmacia Biotech”, США), альбумін сироватки крові бика (“Calbiоchem”, США). Неорганічні сполуки ступеню чистоти 'хч' або вищої. Планшети для ІФА (“Costar”, США; “Nunc”, Nalge Nunc Inte ational, США).
Одержання плазміногену. Глу-плазміноген одержували з донорської плазми на лізин – сефарозі. Ліз-форму плазміногену – з фракції ІІІ2,3 за Коном також на лізин – сефарозі. Проводили гель-фільтрацію на Sephacryl S-200. Препарати плазміногенів зберігали при –20oС. Одержані препарати плазміногену мали потенційну протеолітичну активність 18-22 казеїнолітичні одиниці на 1 мг білка. Спонтанну активність у препараті плазміногену не виявляли за інкубації протягом 6 годин з хромогенним субстратом S-2251. Чистоту одержаних препаратів контролювали електрофоретично в 10% ПААГ з ДС-Na, та в 11,5 % ПААГ з оцтовою кислотою і сечовиною за рН 3.2.
Одержання препаратів плазміну. Плазмін одержували з препаратів Глу-плазміногену за стандартною методикою з використанням імобілізованої на BrCN-сефарозі-4В урокінази. Плазміноген інкубували з імобілізованою урокіназою протягом 1 години при температурі 370С у 0,05 М трис-НCl буфері, рН 7.4, з вмістом 0,15 М NaCl і 25% гліцерину.
Вимірювання амідолітичної активності плазміну. Активність плазміну визначали за вивільненням паранітроаніліну з хромогенного субстрату S-2251 (H-D-Вал-Лей-Ліз-pNa) – 3 мМ, яке реєстрували в двохвильовому режимі за 405 та 492 нм на ридері-спектрофотометрі для мікропланшетів Titertek Multiskan МС (Фінляндія). Реакцію проводили в планшетах для імуноферментного аналізу в 0,05 М трис-НСІ буфері рН 7,4. який містив 0,15 М NaCI, при 37oС, концентрація плазміногену становила – 100 нМ (25 пмоль), стрептокінази – 10 мл і S-2251- 0,3 мМ. Кінцевий об'єм проби – 250 мкл
Вплив a2-антиплазміну на реакцію індукції каталітичної активності Глу–плазміногену моноклональним антитілом IV-Ic. У реакційне середовище вносили послідовно: Глу-плазміноген до кінцевої концентрації 100 нМ, a2-антиплазмін до кінцевої концентрації 30 нМ (7,5 пмоль), антиплазміногенове моноклональне антитіло IV-1c - 100 нМ (25 пмоль), 100 мМ фосфатний буфер рН 7.4, хромогенний субстрат S-2251 (0,3 мМ). Реагенти змішували при кімнатній температурі, реакцію проводили при 37оС.
Вплив двовалентних катіонів на індукцію каталітичної активності Глу-плазміногену моноклональним антитілом IV-1c. Хлориди двовалентних металів розчиняли у 0,1 М трис – HCl буфері, pН 7.4 до кінцевої концентрації 1,5 мМ. Цей буфер правив за основний під час реакції.
Вплив іонної сили розчину та аніонів на реакцію активації Глу-плазміногену моноклональним антитілом IV-Ic. Іонну силу розчину змінювали за допомогою хлориду натрію, вплив аніонів визначали, додаючи відповідні натрієві солі.
Електрофорез у гелі за присутності Електрофорез проводили за методом Laemmli. Як маркери використовували LMW Calibration Kit (Amersham Biosciences, США) до якого входять такі білки: 94 67 43 30 20,1 – соєвий інгібітор трипсину, 14,4 кДа – a-лактальбумін.
Електрофорез у поліакриламідному гелі за низьких значень рН. Для визначення форм плазміногену людини використовували 7.5% ПААГ з вмістом 6.25 М сечовини з доведенням рН оцтовою кислотою до 3.2. За таких умов розділення Глу- та Ліз- плазміногенів відбувається за рахунок різниці зарядів молекули.
Одержання стрептокінази. Стрептокіназу одержували з комерційного препарату (Kabikinase, Швеція) афінною хроматографією на Cibacron Blue-Sepharose. Питома активність препаратів стрептокінази була не меншою за 97000 IU/мг білка. За даними електрофорезу препарати стрептокінази не містили домішок альбуміну та були гомогенними.
Очищення імуноглобулінів. Антиплазміногенове моноклональне антитіло IV-1c отримували з супернатантів гібридомних клітин, люб’язно наданих старшим науковим співробітником Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України Іриною Миколаївною Колесніковою. До клітинного супернатанту додавали сульфат амонію до кінцевої концентрації 45 – 50% і залишали на 10 годин при 4оС. По тому центрифугували протягом 30 хвилин за 2000 об./хв на центрифузі РС-6. Супернатант видаляли, а до преципітату додавали 0,05М трис-HCl буфер, рН 7,4, з вмістом 0,13М NaCl до повного розчинення осаду та діалізували проти того ж буферу.
Отримання моноклональних антитіл IV-lc методом афінної хроматографії з використанням протеїн А-Sepharose. На колонку з протеїн А-Sepharose наносили віддіалізовані імуноглобуліни, відмивали незв'язаний білок 0,05М трис-HCl буфером, рН 7,4, з вмістом 0,13М NaCl з відповідним спектрофотометричним контролем за довжини хвилі 280 нм. Елюцію проводили 0.1 М гліциновим буфером, рН 2,8. Елюат негайно нейтралізували 1М трис до pH 7.8. Фракції діалізували проти 0,05М трис-HCl буферу, рН 7,4, з вмістом 0,13М NaCl або 50 мМ натрій-фосфатного буферу, рН 7,4, протягом ночі при температурі 4оС.
Очистка антиплазміногенового моноклонального антитіла IV-1c методом афінної хроматографіі на колонці з Пг-Sepharose. Ha врівноважену 0,05М трис-HCl буфером, рН 7,4, з вмістом 0,13М NaCl або 50 мМ натрій-фосфатним буфером, рН 7,4, колонку з плазміноген-Sepharose наносили фракцію імуноглобулінів. Незв'язаний білок відмивали тим же буфером. Елюцію проводили послідовно 0.1 М гліциновим буфером, рН 2,8 та рН 2.2. Елюат нейтралізували 1М трис до рН 7,8. Отримані антиплазміногенові IgG діалізували протягом ночі при 4оС проти 0,05М трис-HCl буферу, рН 7,4, з вмістом 0,13М NaCl. Елюйовані за рН 2.2 антитіла IV-1c мали здатність інгібувати індукцію каталітичної активності плазміногену стрептокіназою та індукувати таку активність самі.
Контроль наявності домішок з амідолітичною активністю у препаратах моноклонального антитіла IV-1c. Чистоту фракції імуноглобулінів після плазміноген-Sepharose контролювали електрофоретично, наявності білкових домішок не виявлено. Можливість наявності амідолітичної активності перевіряли, інкубуючи препарат антитіл з урокіназою та S2251 за стандартних умов. Протягом 10 годин інкубації амідолітичної активності у препаратах не виявлено.
Інгібування моноклональним антитілом IV-1c індукції каталітичної активності плазміногену стрептокіназою. В комірку планшету для імунохімічних реакцій послідовно додавали плазміноген (25 пмоль), 0,05М трис-HCl буфер, рН 7,4, з вмістом 0,13М NaCl, розчин антитіла IV-1c концентрацією 0-85 пмоль, субстрат S-2251 (0,3мМ) до кінцевого об'єму 250 мкл. Реакцію індукції каталітичної активності плазміногену ініціювали стрептокіназою (10 IU/мл) при 37оС і реєстрували як сказано вище.
Визначення швидкості утворення активних центрів плазміногену у комплексі Пг-МКА IV-1c. Попередньо інкубовану суміш плазміногену та IV-1c в еквімолярних концентраціях додавали до розчину хромогенного субстрату S-2251 у 0,05М трис-HCl буфер, рН 7,4, з вмістом 0,13М NaCl до кінцевого об’єму 250 мкл та інкубували при 37оС. Виміри проводили протягом 10 хв з 0.5 - 1 хвилинним інтервалом. Швидкість індукції каталітичної активності визначали за рівнянням V=([Пм2]-[Пм1])/Dt, де [Пм2] – концентрація активних центрів (Пм) в момент переходу кривої до лінійного росту (t2), [Пм1] – їхня концентрація в момент закінчення лаг-фази (t1), Dt=t2-t1. Концентрацію Пм визначали за допомогою калібрувальної кривої активності плазміну, побудованої в координатах [Пм]ёtg a, де tg a є тангенсом кута зростання А405 за певної концентрації плазміну.
Імобілізація ліганда на BrCN-Sepharose 4B. Імобілізацію проводили за стандартною методикою (Amersham Biosciences, США).
Визначення концентрації білка за поглинанням в УФ-області спектру. Визначення концентрації білків проводили на спектрофотометрі СФ-46 (ЛОМО, Росія) у кюветах з довжиною пробігу променя 1 см. Для індівідуальних білків враховували коефіцієнти молярної екстинкції, а саме: для плазміногену – 17,0, для моноклонального антитіла IV-1c – 14,0 і для стрептокінази – 6,7.
Імуноферментний аналіз (ІФА/ELISA). Імуноферментний аналіз проводили за загальноприйнятою методикою з використанням субстрату лужної фосфатази – pNPP (п-нітрофеніл фосфат) у 0,01 М диетаноламіновому буфері, рН 9,5. Визначення оптичного поглинання проводили у двохвильовому режимі за довжини хвилі 405 та 492 нм на ридері-спектрофотометрі для мікропланшетів Titertek Multiskan МС.
Отримання донорської плазми крові. До роботи брали пул крові не менше ніж 10 донорів. Кров одержували пункцією ліктьової вени, натщесерце, з додаванням розчину лимоннокислого натрію (38 г/л) у співвідношенні 9:1 з подальшим центрифугуванням за 1500 g протягом 40 хвилин.
Математична обробка результатів досліджень. Математичну обробку та аналіз отриманих експериментальних даних виконували за допомогою пакету ORIGIN 6.1. До роботи включено лише результати експериментів, чия допустима похибка не перевищувала 5 відсотків (р < 0,05). |
