АНІЛІДИ ХІНОЛІН-КАРБОНОВИХ КИСЛОТ – ПЕРСПЕКТИВНИЙ КЛАС ПОТЕНЦІЙНИХ КОРЕКТОРІВ КИСЛОТНО-ЛУЖНОЇ РІВНОВАГИ І ВОДНО-ЕЛЕКТРОЛІТНОГО ОБМІНУ ОРГАНІЗМУ

Краткое содержание

Матеріали та методи дослідження. Експериментальні дослідження виконані на 180 білих нелінійних статевозрілих мишах масою 18-25 г, 755 білих нелінійних статевозрілих щурах масою 180-220 г, 20 кролях породи   Шиншила масою 2,5-2,7 кг, 64 спонтанно гіпертензивних щурах, 30 щурах лінії Вістар. Тварини вирощені у розпліднику віварію ЦНДЛ НФаУ (зав. лабораторією  д. фарм. н., професор Л.В. Яковлева). Робота з тваринами проводилась згідно з  міжнародними вимогами про гуманне ставлення до тварин та з дотриманням вимог директиви 86/609/ЕЕС з питань захисту тварин, а також “Методическими рекомендациями по выведению лабораторных животных из эксперимента” [Киев, 1986]. Усі маніпуляції, які можуть завдати болю, проведені під етамінал-натрієвим наркозом [О.В. Стефанов, 2001]. Комітетом з біоетики НФаУ (протокол № 12/1 від 10.12.2008 р.) встановлено, що проведені дослідження не суперечать загальноприйнятим біоетичним нормам з дотримання відповідних міжнародних положень стосовно проведення експериментальних досліджень. Дослідження проводили в Центральній науково-дослідній лабораторії НФаУ, яка сертифікована ДФЦ МОЗ України (посвідчення № 34 від 29.12.2005 р.).

Матеріал дослідження – новий ряд хімічних сполук – аніліди хінолін-карбонових кислот синтезовані на кафедрі фармацевтичної хімії НФаУ під керівництвом  д. хім. н., професора І.В. Українця.  Всі синтезовані аніліди 4-метил-2-оксо-1,2-дигідрохінолін-3-карбонової кислоти (аніліди 1-гідрокси-3-оксо-5,6-дигідро-3Н-піроло-[3,2,1-ij]-хінолін-2-карбонової кислоти) являють собою безбарвні або білі з жовтим відтінком кристалічні речовини, при кімнатній температурі практично не розчинні у воді, мало розчинні у спирті і помірно розчинні у диметилформаміді і диметилсульфоксиді. Для підтвердження їх хімічної будови використана спектроскопія ядерно-магнітного резонансу протону водню (ЯМР¹Н).

Вивчення гострої токсичності (LD₅₀) анілідів хінолін-карбонових кислот проводили на мишах при внутрішньочеревинному введенні в об’ємі 1 мл одноразово за методом Cr. Karber. Ступінь токсичності визначали за загальноприйнятими таблицями [К.К. Сидоров, 1973], ефективну дозу (ЕD₅₀) розраховували за методом Cr. Karber. Можливу загальнотоксичну дію на органи і системи вивчали згідно з Методичними рекомендаціями ДФЦ МОЗ України (2001). Вивчали вплив на:

– загальний стан тварин, який оцінювали за динамікою маси і температури тіла тварин;

– функціональний стан серцево-судинної системи – за показниками електрокардіограми  [И.А. Западнюк и др., 1983; Т.А. Гуськова, 2003];

– склад периферійної крові, який визначали за кількістю еритроцитів, лейкоцитів, гемоглобіну, швидкістю зсідання еритроцитів та лейкоцитарною формулою [В.В. Меньшиков, 2002];

– функціональний стан печінки – за кількістю загального білка, фракційним складом білків, ферментів аланінамінотрансферази, аспартатаміно-трансферази [В.В. Меньшиков, 2002];

– функціональний стан нирок – за якісним визначенням білка в сечі, визначенням рН, питомої ваги, яку вимірювали урометром; кількості азоту сечовини сироватки крові, яку визначали уніфікованим діацетилмонооксимним методом [О.П. Тимошенко та cпівавт., 2003; В.В. Меньшиков, 2002].

Вивчали вплив карборену на функціональні, морфологічні показники сперматогенезу і репродуктивної функції щурів [І.Р. Бариляк, Л.В. Неумержицька, 2001]. Первинну фармакологічну оцінку діуретичної дії нових субстанцій проводили за методом Є.Б. Берхіна [1977]. Досліджувані субстанції і гіпотіазид вводили внутрішньошлунково у вигляді тонкодисперсної водної суспензії, стабілізованої твіном-80 у дозі 40 мг/кг.

Середньосмертельну і середньоефективну дози карборену визначали на двох видах лабораторних тварин – нелінійних білих мишах і білих щурах за умов внутрішньочеревинного та внутрішньошлункового введення за методом Cr. Karber.

Експериментальне вивчення фармакокінетики карборену проводили методом високоефективної рідинної хроматографії на хроматографі “Мілі-хром-А-02”. Розрахунок фармакокінетичної моделі проводили із застосуванням програми “Borgia” [Соловьев В.Н., Фирсов А.А., Филов В.А., 1980].

Функціональний стан нирок у щурів під впливом анілідів хінолін-карбонових кислот на прикладі карборену  вивчали за умов спонтанного та індукованого діурезу після одноразового і багаторазового уведень. Проведені розрахунки швидкості клубочкової фільтрації, канальцевої реабсорбції та інших показників за загальноприйнятими формулами [Шюк О.Ю., 1982; Рябов С.И. и соавт., 1997]. Концентрацію іонів натрію й калію в сечі і плазмі крові визначали  методом полуменевої фотометрії на плазмовому аналізаторі рідин ПАЖ-2 [Бардин В.В., Войчинова Е.С., Булатов М.И., 1988], концентрацію креатиніну (мкмоль/л) у плазмі крові визначали на спектрофотометрі СФ-46 при довжині хвилі 590 нм за методом Фоліна у модифікації Є.Б. Берхіна [1977]. Концентрацію білка в сечі визначали за методом Міхєєвої А.П., Богодарової І.А. [1996]. Як референт-препарати були обрані гіпотіазид і спіронолактон.

Для дослідження впливу карборену на показники діяльності нирок за умов зниженої мінералокортикоїдної активності у щурів була відтворена модель блокади альдостеронових рецепторів [Куковська І.Л., 2004] шляхом перорального уведення тваринам спіронолактону фірми “Гедеон Ріхтер” (Угорщина) у дозі 20 мг/кг. Враховуючи гіпотензивну дію карборену та імовірність використання цієї субстанції за умов різної мінералокортикоїдної активності, було досліджено  її  вплив на основні показники діяльності нирок на тлі підвищеної активності мінералокортикоїдів та з’ясування можливої ролі цих гормонів у реалізації ниркових ефектів карборену. Такі умови створювались шляхом уведення 0,5 % олійного розчину дезоксикортикостерону ацетату (АТ “Фармадон”, Росія) в дозі 10 мг/кг протягом 4 днів.

Взаємодію карборену з інгібіторами дофамінових рецепторів вивчали в експерименті з антагоністом дофаміну домперидоном виробництва фірми “Янссен фармацевтика Н.В.” (Бельгія) [Сергеев П.В. и соавт., 1999]. Домперидон уводили перорально в дозі 40 мг/кг.

Вивчення впливу карборену на зміни екскреторної функції нирок в умовах  уведення L-аргініну  проводили на 4 групах щурів-самців. Перша група – інтактний контроль, щури другої та третьої груп отримували карборен у дозі 10,7 мг/кг і L-аргінін у дозі 0,1 мг/кг внутрішньошлунково, четвертій групі щурів уводили одночасно карборен і L-аргінін перорально в аналогічних дозах. Сечу для дослідження збирали через 2 год за методом Берхіна Є.Б. [1977].

Для визначення змін діяльності нирок під впливом карборену за умов зниженої активності ренін-ангіотензин-альдостеронової системи (РААС)  дослідження проводились після 7 денного введення препарату. Інгібітор ангіотензинперетворювального ферменту (АПФ) еналаприл (ТОВ ФК “Здоров’я”, Україна)  уводили тваринам у шлунок через зонд у дозі 10 мг/кг на

1 % зависі крохмалю протягом 4 днів до проведення експерименту.

Вплив карборену на натрійуретичну активність плазми крові щурів досліджували за умов збільшення об’єму позаклітинної рідини в організмі. Попередньо було проведене біологічне тестування плазми крові щурів [Іванов Ю.І. та співавт., 1980] на натрійуретичну активність, яку визначали за ек-скрецією іонів натрію з сечею і оцінювали в ум.од/мл натрійуретичного гормону (НУГ). За умовну одиницю приймали таку його кількість, яка здатна в 2 рази збільшити натрійурез порівняно з контрольними експериментами [Кубынин А.Н. и соавт., 2000]. Продукцію НУГ стимулювали збільшенням об’єму позаклітинної рідини введенням у хвостову вену щурів 0,9 % розчин натрію хлориду в кількості 3 % від маси тіла. Контрольну і дослідну плазму тварин тестували на 10 щурах. НУГ плазми крові визначали за формулою:

К = (М₁· М₂ – m₁m₂)·Р^-1·(М₁–М₂)^-1, де К – вміст НУГ в 1 мл плазми крові; М₁ – середня величина екскреції іонів натрію з сечею у контрольних тварин; m₁ – стандартна похибка середньої арифметичної цього показника у контрольних тварин; М₂ – середня арифметична величина екскреції іонів натрію у дослідних тварин; m₂ – стандартна похибка середньої арифметичної цього показника у дослідних тварин; Р – об’єм уведеної для тестування плазми крові в мл [Куковська  І.Л., Косуба  Р.Б., 2000; Куковська  І.Л., 2004].

Дегідратаційну дію анілідів хінолін-карбонових кислот вивчали на двох моделях набряку легень: адреналіновому – у мишей і хлорамонійному – у щурів [Галин Ю.М., Мартынов В.А., 1973; Сернов Л.Н., Гацура В.В., 2000]. Адреналіновий набряк легень у тварин викликали внутрішньочеревинним уведенням офіцинального (0,1 %) розчину адреналіну в дозі 0,1 мг/10 г маси тіла. Хлорамонійний набряк легень викликали шляхом внутрішньочеревинного введення  6 % розчину хлористого амонію з розрахунку 0,7-0,75 мл/100 г маси тіла. Карборен уводили внутрішньошлунково в дозах 30, 50 і 80 мг/кг кг (дози, які перевищують у 3, 5 і 8 разів ЕД₅₀) за 20 год до викликання набряку. За станом тварин спостерігали протягом 1 год, потім їх виводили з експерименту під ефірним наркозом, легені ретельно оглядали, витягали та зважували. Ступінь вираженості набряку легень оцінювали за виживанням тварин, зовнішнім виглядом органа, а також за легеневим коефіцієнтом, що являє собою відношення маси легень до маси тіла тварини.

Вплив карборену на розвиток осмотичного набряку головного мозку у мишей вивчали шляхом внутрішньочеревинного уведення тваринам великої кількості води (21-22 % від маси тіла), що викликає різке порушення осмотичної рівноваги і, як наслідок, накопичення великих кількостей рідини в тканині мозку [Самвелян В.М.,1981]. Карборен уводили за 20 год у дозах 50 мг/кг і 100 мг/кг (дози, які перевищують у 5 і 10 разів ЕД₅₀). За тваринами спостерігали 1 год. Оцінку ступеня вираженості набряку і протинабрякової дії карборену проводили за станом тварин та ваговим коефіцієнтом мозку, вираженим у відсотках. Поряд з цим визначали  вміст води в головному мозку шляхом його висушування до постійної маси при температурі 105 °С у сушильній шафі. Вміст води розраховували  як різницю між вологою і сухою масою мозку в мг і  відсотках.

Вивчення міотропної спазмолітичної активності анілідів хінолін-карбо-нових кислот  виконано на щурах обох статей лінії Вістар масою 160-190 г. Евтаназію тварин проводили шляхом цервікальної дислокації. В дослідженнях використовували ізольовані кільця грудного сегмента аорти та кільця правої ниркової артерії. Аорту та ниркову артерію видаляли негайно після розтину і зберігали в охолодженому розчині Кребса-Рінгера (який містить у mМ: 132 NaCl, 4,7 KCl, 1,4 NaH₂PO₄, 1,0 MgCl, 2,1 CaCl, 21 NaHCO₃, 6,5 глюкози, рH 7,3; підтримували шляхом продування газовою сумішшю 5 % СО₂/95 % повітря). Ізольовані судини очищували від жирової та сполучної тканин на зовнішній поверхні, розрізали на кільця шириною 1-2 мм [Guedes D.N., et al., 2004]. Механографічне дослідження м’язових скорочень ізольованих судин проводили на експериментальній установці. Дані реєструвались за допомогою аналогоцифрового перетворювача ( WPI LabTrax 4/16, США) на персональний комп’ютер з використанням програми DataTrax 2. Кільця судин розміщували в проточній горизонтальній камері (0,5 мл), яку перфузували розчином Кребса (1-1,5 мл/хв) при (37±0,5) °С, та розтягували на двох сталевих гачках з попереднім навантаженням 15 та 10 mN ( для аорти та ниркової артерії відповідно). Силу скорочувальних реакцій судин реєстрували в ізометричному режимі за допомогою ємнісних тензометричних датчиків (FTK-0.1). Вимірювання амплітуди скорочень кілець аорти та ниркової артерії проводили після стабілізації їх реакції на періодичну стимуляцію гіперкалієвим розчином Кребса (KCl, 60 mM) протягом 40-60 хвилин. Рівень спазмолітичного ефекту обчислювали у відсотках відносно рівня максимального тонічного напруження, викликаного фенілефрином (1 мкмоль/л) [Tirapelli C.R., et al., 2006]. Для розрахунку середньоефективної концентрації (log ЕС₅₀) застосовували графічний метод побудови кривих «доза–ефект» за допомогою програми Origin 7.5 (OriginLab Co., США). Дослідну сполуку розчиняли у диметилацетаміді та подавали в експериментальну камеру в наростаючій концентрації від 100 нмоль/л до 100 мкмоль/л.

Гіпотензивну дію анілідів хінолін-карбонових кислот вивчали на двох моделях  гіпертензії: індометациновій  і  вазоренальній.

Індометацинову гіпертензію моделювали шляхом хронічного уведення інгібітора синтезу простагландинів – індометацину – на тлі зміни функціонального стану нирок завдяки сольовому навантаженню [Либерман Т.Ю., 1971].  АГ у щурів викликали щоденним, протягом  6 тижнів, 1 % розчином NaCl, який тварини одержували замість питної води, в сполученні з уведенням усередину індометацину в дозі 2 мг/кг  [Куница Л.Д., 1983].  У всіх тварин вимірювали артеріальний тиск (АТ) у хвостовій артерії за модифікованим методом, що заснований на принципі Ріва-Роччі, на приладі BE RECORDER (Італія). Для визначення вихідного рівня АТ для кожної тварини реєстрацію тиску проводили 2 рази протягом доби. При цьому середній рівень артеріального тиску (САТ) був розрахований як середня величина з 3-4 паралельних вимірів. Для дослідів були відібрані тварини із підвищеним САТ, величина якого склала в середньому 155±1,8 мм рт.ст.

Експериментальну вазоренальну гіпертензію викликали у кролів різної статі масою 3,0-3,5 кг дозованим звуженням однієї із ниркових артерій,  використовуючи принцип класичного методу Голдблатта [Либерман Т.Ю., 1971]. Вивчення гіпотензивної дії карборену і гіпотіазиду проводили через 1 місяць після відтворення патології. Тривалість уведення препаратів – 10 днів. Реєстрацію АТ проводили на 1, 5 і 10 добу.

Поглиблене вивчення дії карборену як антигіпертензивного засобу проводили на спонтанно гіпертензивних щурах, отриманих з розплідника лабораторних тварин “Біомодельсервіс” (м. Київ). У період акліматизації після перевезення з розплідника (2 тижні) та протягом експерименту щури знаходилися у віварії при t 20-25 °С, вологості не більше 50 %, природному світловому режимі «день-ніч», у стандартних пластикових клітках, на стандартному харчовому раціоні [Коваленко В.М., Стефанов О.В., Максимов Ю.М., Трахтенберг І.М., 2001].

Вплив на АТ та частоту серцевих скорочень (ЧСС) субстанції карборен вивчали при одноразовому (І серія дослідів) і 7-денному (ІІ серія дослідів) уведенні щурам при вивченні водно-сольового обміну. Вплив карборену на електролітний склад крові та стан реноваскулярної системи досліджували  при його 7-денному (у щурів ІІ серії дослідів) уведенні, визначали в крові концентрацію іонів калію, натрію та хлору, а також вміст креатиніну, сечовини та рівень загального білка. Препаратами порівняння були таблетки гіпотіазиду, які містять 25 мг гідрохлортіазиду (“Хіноїн”, Угорщина, серія 0627) та таблетки берліприлу, які містять 5 мг еналаприлу малеату (“Берлін-Хемі АГ”, Німеччина, серія 71002). Карборен і гідрохлортіазид уводили в дозі 10,7 мг/кг. Доза еналаприлу 5 мг/кг відповідає діапазону добових доз для людини з розрахунком коефіцієнта перерахунку на щурів, а також коливається в діапазоні фармакологічно активних його доз в експерименті [А.П. Викторов, 2005; Кобалова Ж.Д., Котовская Ю.В., 2007]. АТ та ЧСС у щурів реєстрували в хвостовій артерії неінвазивним методом за допомогою реєстратора артері-ального тиску ВР Recorder (“Ugo Basile”, Італія). На підставі отриманих результатів у кожній серії дослідів формували однорідні за рівнем АТ групи. В день досліду у щурів реєстрували вихідний рівень АТ і відразу після цього їм уводили у шлунок карборен та референтні препарати. Ефекти препаратів оцінювали за змінами АТ відносно вихідного рівня, приймаючи його за 100 %. Згідно із загальноприйнятими в біології підходами антигіпертензивний ефект препаратів розраховували як в цілому в кожній експериментальній групі, так і окремо в підгрупах щурів, у яких АТ під впливом вивчених препаратів знижувався на 5 % та більше відносно вихідного рівня. Це дозволило глибше оцінити потенційні антигіпертензивні властивості карборену.

Досліди при 7-денному уведенні субстанції карборен, гідрохлортіазиду і еналаприлу проведені на  щурах-самцях. Препарати, які порівнюються, уводили  раз на день протягом 7 днів. На 7-й день після початку експерименту через 4 год після останнього уведення препаратів у щурів реєстрували АТ і ЧСС. Відразу після реєстрації АТ і ЧСС проводили евтаназію тварин методом декапітації, в крові визначали вміст креатиніну та сечовини за допомогою тест-наборів (“Pliva-Lachema Diagnostika”, Чехія) та рівень загального білка за допомогою тест-набору (“Філісит-Діагностика”, Україна). Вміст у крові концентрації іонів К⁺, Na⁺ i Cl^– визначали за допомогою аналізатора Na/К/Cl  “Easylyte” (“Medica”, США) з використанням проточних іонселективних   електродів.

Кислотно-лужний стан і газовий склад крові за умов уведення карборену вивчали за методом [Р.Astrup, 1955] на БМС-3МК-2 мікроаналізаторі кислотно-лужної рівноваги фірми “Радіомер” (Копенгаген, Данія). За нормограмою Sіggaard-Andersen знаходили: рСО₂ – парціальний тиск вуглекислого газу, мм рт.ст.; рО₂ – парціальний тиск кисню, мм рт.ст.; BE (Base Excess) – надлишок чи нестачу буферних основ, моль/л; SB (Standard Bіcarbonate) – стандартний бікарбонат, моль/л; AB (Actual Bіcarbonate) – справжній бікарбонат, моль/л; BB (Buffer Base) – суму буферних основ, моль/л; tCO₂ – тотальний вуглекислий газ, мм рт.ст.; HbО₂ – рівень оксигемоглобіну, %.

Визначення активності сукцинатдегідрогенази (СДГ) у звивистих канальцях нефрону проводили за Нахласом, Валькером і Зелігманом [А.И. Кононский, 1976].  Визначення активності АТФази, яка активується іонами натрію і калію (Na⁺,К⁺-АТФаза, або транспортна АТФ-аза) – за допомогою гіс-тохімічного методу, який  базується на принципі Гоморі і Такаматсу [Х. Луп-па, 1980].

Статистичну обробку результатів проводили з використанням пакета статистичного аналізу електронних таблиць Exel [Лапач С.Н., Чубенко А.В., Бабич П.Н., 2000] та за допомогою програми “Statgra-phics Plus v. 3.0.”  Вірогідність різниць між середніми визначали за критерієм Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Першим етапом роботи була скринінгова серія дослідів з вивчення гострої токсичності [Cr. Karber] і діуретичної активності [Берхін Є.Б.]  35 анілідів хінолін-карбонових кислот. Результати досліджень свідчать, що гостра токсичність зазначених сполук знаходиться в межах від 850 до 3750 мг/кг. Найменш токсичними виявилися субстанції під шифрами PQ₅₅ і PQ₄₀, середня летальна доза яких при внутрішньочеревинному уведенні білим мишам до-рівнює 3750 і 3500 мг/кг відповідно.

У серії скринінгових досліджень виявлено, що серед вивчаємих сполук найбільш виражену діуретичну активність виявила субстанція під шифром PQ₄₀ у дозі 40 мг/кг, яка перевищувала дію гіпотіазиду в 1,23 рази. Поряд з цим виражену діуретичну дію виявили сполуки під шифрами PQ₄₈, PQ₄₉, PQ₅₇ і PQ₆₄. Також встановлено, що сполуки під шифрами PQ₄₇, PQ₅₂, PQ₇₀ і PQ₇₂ володіють антидіуретичним ефектом.

Зіставляючи отримані експериментальні дані на виявлення в анілідів 1-гідрокси-3-оксо-5,6-дигідро-3Н-піроло-[3,2,1-ij]-хінолін-2-карбонової кислоти здатності стимулювати видільну функцію нирок у дослідних тварин з результатами попередніх досліджень [Українець І.В., 2007], можна зробити висновок, що аніліди хінолін-карбонових кислот виявляються більш активними, ніж відповідні їм бензиламіди з аналогічними замісниками в ароматичному кільці. Зафіксований тільки один приклад – (PQ₄₄), коли видалення з молекули метильного радикала, який розділяє амідний атом азоту і арома-тичне ядро, призводило до зниження діуретичних властивостей. У всіх останніх випадках подібна модифікація може бути визнана доцільною. В групі анілідів, які містять  як замісники карбоксильні групи, а також їх структурні аналоги (PQ₄₃-PQ₄₆) з групами, які здатні в умовах in vivo перетворюватися на карбоксильні, сечогінні властивості взагалі не виявлені. 2-Суль-фамоїльне похідне (PQ₄₂) і його нейтральний 2-карбамоїльний аналог (PQ₇₃), незважаючи на помітну різницю в кислотних властивостях, проявляють однаковий помірний діуретичний ефект.

Таким чином, отримані дані з вивчення діуретичної активності свідчать, що перехід від бензиламідів до анілідів 1-гідрокси-3-оксо-5,6-дигідро-3Н-піроло-[3,2,1-ij]-хінолін-2-карбонової кислоти з тими ж замісниками в ароматичному амідному ядрі в більшості випадків супроводжується помітним підсиленням діуретичних властивостей. Збільшення кількості атомів фтору в молекулі призводить до зростання токсичності хімічної сполуки. Аніліди (PQ₄₇, PQ₅₂, PQ₇₀ і PQ₇₂), отримані на основі нітрилів, амідів і складних ефірів ароматичних карбонових амінокислот, діуретичними властивостями не тільки не володіють, але в деяких випадках (2-карбамоїланілід – PQ₄₃) навіть значно пригнічують сечовиділення.