ПАТОФІЗІОЛОГІЧНІ МЕХАНІЗМИ ПАТОЛОГІЧНО ПОСИЛЕНОЇ ЗБУДЛИВОСТІ ГОЛОВНОГО МОЗКУ ЗА УМОВ ЗАСТОСУВАННЯ БАКТЕРІАЛЬНОГО ЛІПОПОЛІСАХАРИДУ (експериментальне дослідження) : ПАТОФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕХАНИЗМЫ патологически усиленного возбудимости головного мозга в условиях применения БАКТЕРИАЛЬНОГО липополисахарида (экспериментальное исследование)

Краткое содержание

Матеріали та методи досліджень. Екcперименти виконані на щурах- самцях лінії Віcтар маcoю 180-320 г, кoтрі знаходились за стандартних умов утримання віварію ОДМУ. Досліди проводили згідно вимог GLP та комісії біоетики ОДМУ (протокол № 84  від 10 жовтня 2008 р.). В експериментах на моделях епілептичної активності використовували препарат «Пірогенал» (НДІ ім. М.Ф.Гамалеї РАМН, РФ), що містить ЛПС, і котрий вводили в дозах від 0,05 до 1,0 мг/кг, внутрішньоочеревинно (в/очер). Тваринам контрольної групи за аналогічних умов застосовували 0,9 % фізіологічного розчину натрію хлориду.

Фармакологічний кіндлінг відтворювали за допомогою повторних введень коразолу (“Sigma”, США) (25,0- 30,0 мг/кг, в/очер) [Шандра А.А. и соавт., 1999]. Осередки епілептогенезу моделювали шляхом застосування розчину бензилпеніциліну натрію ("Sandoz GmbH", Австрія) (10000 ОД/мл), каїнової кислоти (2,0 мг/мл) і стрихніну (30,0 мг/мл) (“Sigma”, США), які вводили в гіпокамп за координатами стереотаксичного атласу у об’ємі 2,0 мкл.

Гострі генералізовані судоми моделювали шляхом застосування розчину бензилпеніциліну-натрію ("Sandoz GmbH", Австрія) (3000000 ОД/кг, в/очер) [Mrangoz C., Bagrici F., 2003], а також за допомогою внутрішньошлуночкового застосування розчину каїнової кислоти в дозі 0,6 мкг/тварину, яка викликала клонічні судоми [White H.S. et al., 1992]. Розраховували середньоефективні дози епілептогенів (ED₅₀).

Оцінку рухової активності здійснювали методом відкритого поля [Александрова Н.Г. и др., 1984]. Дослідження післянападової депресії- поведінкових та позно-тонічних реакцій здійснювали за методикою M.Myslоbоdsky et al. (1981). Крім того, досліджували показники циклу сон-неспання, для чого проводили безперервне 4-годинне спостереження щурів.

Тваринам імплантували ніхромові електроди в структури мозку під нембуталовим наркозом (40,0 мг/кг, в/очер) та використовували в дослідженні через 7-14 діб з моменту оперативного втручання.

            Запис електроенцефалограми (ЕЕГ) проводили за частоти опитування каналів 256 імп/с з допомогою аналого-цифрового перетворювача («DX-Системи», Харків) - дані візуалізували на екрані і зберігали на жорсткому диску для наступної off-line обробки. Частотний діапазон сигналів складав 0,5-40 Гц. На фрагментах ЕЕГ визначали показники потужності сигналу (мкВ²).  

            Для визначення вмісту в білковій та небілковій фракціях крові сульфгідрильних (SH-) і дисульфідних (SS-) груп використовували амперометричне титрування нітратом срібла [Соколовский В.В., 1996]. Роздільне визначення вмісту аскорбінової кислоти, її окиснених форм в сироватці крові здійснювали за методом В.В.Соколовского (1996), який базується на здатності 2,4-динітрофенілгідразину при взаємодії з окисненими формами аскорбінової кислоти набувати червоного кольору.

            Транскраніальні магнітні подразнення проводили за допомогою апарату «Авімп», який генерував імпульси з індукцією на висоті їх розвитку в 1,5 Тл. Магнітними імпульсами впливали з відстані 2,0-3,5 см на потиличну зону черепу тварин, яких тимчасово фіксували в пластмасових футлярах. Електричні подразнення розпочинали через 10-14 діб з моменту оперативного втручання і проводили за допомогою апарату «ЭСУ-2» (Україна) (100-300 Гц, 0,25 мс, 3,0-5,0 В, інтервал між подразненями - 2,5-3,5 хв).

            Для визначення опіат-залежних механізмів ефектів ЛПС застосовували налоксон (1,0-10,0 мг/кг, в/очер) (“Sigma”, США).

            Вcі отримані результати обробляли за допомогою параметричних та непараметричних методів статистичного аналізу [Бyреш Я. і співавт., 1991].

Результати досліджень та їх обговорення. Ефекти ЛПС на розвиток коразолового кіндлінгу. Після 4-ї ін’єкції коразолу, який вводили на тлі застосування ЛПС (0,1 мг/кг, в/очер, за 60 хв до епілептогену), реєструвались окремі судомні здригання у 4 щурів із 10. Після 11-12-го введень коразолу в підгрупі щурів з використанням ЛПС тяжкість судом на 51,5 % була меншою, ніж в групі контролю (P<0,05). В цей період часу у щурів з введенням ЛПС в дозі 0,5 мг/кг, в/очер тяжкість судом також була в два рази меньшою, ніж в групі контролю (P<0,05). Подібні достовірні відмінності зберігались до моменту завершення кіндлінгових введень коразолу (20 ін’єкцій). Причому, латентний період перших судом у щурів з введенням ЛПС в дозі 0,1 мг/кг достовірно зростав після 20-ї ін’єкції коразолу (на 20,5 %), а в групі щурів з введенням ЛПС  в дозі 0,5 мг/кг - після 13-го введення (на 18,2 %) (P<0,05).

            В ЕЕГ після 20-го введення коразолу (30,0 мг/кг, в/очер) у щурів групи контролю через 7,5 хв з моменту введення епілептогену розвивались синхронізовані епілептиформні розряди, амплітуда яких складала від 200 до 750 мкВ, а частота генерування - до 1-2 на с. Їх генерування супроводжувалось генералізованими клоніко-тонічними судомними проявами, які повторювались на протязі двух годин спостереження.  В ЕЕГ у щурів, яким до застосування коразолу вводили ЛПС (0,1 мг/кг, в/очер), епілептоген викликав поодинокі спайкові потенціали, які реєструвались в досліджуваних утвореннях мозку з частотою від 10 до 20 на хв. Амплітуда розрядів складала від 100 до 400 мкВ, і їх генерування супроводжувалось клонічними судомами м’язів тулуба та кінцівок. Подібні спайки реєструвались на протязі від 0,5 до 1,5 год з моменту їх виникнення.

Вплив ЛПС на судоми, які провоковано у віддаленому періоді кіндлінгу. Застосування коразолу в дозі 20,0 мг/кг через 24 год з моменту 21-ї ін’єкції епілептогену викликало клонічні судомні реакції у чверті кіндлінгових тварин, а при збільшенні дози коразолу до 25,0 мг/кг судоми реєструвались у 80,0 % щурів. Причому, у 5 із 8 тварин розвивались генералізовані клоніко- тонічні судомні напади. ED₅₀ коразолу склала 21,6 мг/кг.

У віддаленому періоді кіндлінгу коразол вже в дозі 15,0 мг/кг викликав судоми у третини тварин, а в дозі 25,0 мг/кг - у більш, ніж 90 % всіх щурів. Причому, у більшості щурів (8 із 10) розвивались генералізовані клоніко- тонічні напади. ED₅₀ коразолу склала 16,0 мг/кг, що було достовірно менше у порівнянні з відповідним показником у ранньому періоді кіндлінгу (P<0,05).

            У ранньому періоді дії ЛПС  (4,0 г з моменту введення ЛПС, 0,1 мг/кг, в/очер) коразол в дозі 15,0 мг/кг викликав судомні клонуси у більш, ніж половини кіндлінгових тварин. ED₅₀ в цей період склала 13,9+1,8 мг/кг, що було на 13,2 % менше у порівнянні з показником в групі контролю  (P>0,05). За аналогічних умов відтворення кіндлінгу, але на тлі застосування ЛПС в дозі 0,5 мг/кг, ED₅₀ коразолу склала 12,9+2,2 мг/кг (P>0,05).

            У віддаленому періоді дії ЛПС (14,0 год з моменту введення), який застосовували в дозі 0,1 мг/кг, в/очер, найбільша з досліджуваних доз епілептогену – 30,0 мг/кг викликала клонічні судоми у половини кіндлінгових тварин. ED₅₀ коразолу склала 28,5+2,9 мг/кг, що в 1,78 рази перевищувало аналогічний показник в групі контролю (P<0,05). ED₅₀ за умов застосування ЛПС в дозі 0,5 мг/кг склала 26,7+3,7 мг/кг, що було в 1,67 рази більше, ніж в групі контролю (P<0,05).

            Динаміка змін біоелектричної активності у кіндлінгових щурів за умов застосування ЛПС. Вже через 1,0-3,0 хв з моменту введення коразолу (26,0 мг/кг, в/очер, ED₁₀₀ доза коразолу) у щурів, яким за 4 год до цього вводили ЛПС (0,1 мг/кг, в/очер), виникали перші спайки, частота яких склала 40-60 на хв, а амплітуда - 500-800 мкВ. Ще через 1,0-4,5 хв у всіх тварин в ЕЕГ реєструвалась поява генералізованої судомної активності частотою окремих розрядів до 5-7 на с. При цьому максимальна величина розрядів (500-800 мкВ) реєструвалась у вентрально-базальних відділах мигдалика білатерально. Періоди подібної генералізованої епілептичної активності мали тривалість від 30 с до 2,5 хв та виникали з частотою від 0,5 до 3,0 на хв протягом від 1,0 до 3,5 год і супроводжувались генералізованими клоніко-тонічними нападами.

            Через 14,0 год з моменту застосування ЛПС коразол (26,0 мг/кг, в/очер) викликав у кіндлінгових щурів розвиток спайків через 5,5-11,5 хв з моменту застосування. Розряди амплітудою від 100 до 300 мкВ реєструвались з частотою від 15 до 35 на хв протягом 15-35 хв безперервного спостереження та супроводжувались клонічними скороченнями м’язів кінцівок та тулуба. В жодному випадку не виникали генералізовані судомні напади (P<0,025).

Особливості рухової активності тварин за умов застосування ЛПС. Введення ЛПС в дозі 0,1 мг/кг в/очер на ранньому періоді дії ЛПС (4,0 год з моменту його застосування) приводило до зниження кількості пересічених центральних квадратів на 40,0 % у порівнянні з контролем (P<0,05). Через 14,0 год з моменту використання вказаної дози ЛПС у щурів спостерігалась тенденція до зниження загальної кількості числа пересічених квадратів (в 1,53 рази порівняно з контролем, P<0,05). При цьому також спостерігалось зменшення кількості стійок без опори в 4,3 рази (P<0,05).

Через 14,0 год з моменту застосування ЛПС в дозі 0,5 мг/кг у кіндлінгових тварин спостерігалось зменшення загальної кількості пересічених квадратів- в 1,94 рази порівняно з контролем (P<0,05). У 4,4 рази знижувалась кількість пересічених центральних квадратів і в 6,0 раз кількість стійок без опори (P<0,05).

Кількість стійок з опорою зменшувалось у 3,7 рази (P<0,05). Кількість заглядань в отвори підлоги, кількість епізодів грумінгу, а також урінацій та дефекацій знижувались відповідно у  2,8; 4,4 і в 4,5 рази (P<0,05).

            Досліджувані показники рухової активності кіндлінгових щурів, які реєструвались через 14,0 год з моменту застосування ЛПС (0,1 мг/кг, в/очер) під впливом налоксону (10,0 мг/кг, в/очер) не мали достовірних відмінностей порівняно з контролем, в тому числі, і при порівнянні з групою кіндлінгових тварин, яким застосовували налоксон в аналогічній дозі.

Позно-тонічні рухові реакції кіндлінгових щурів  протягом післянападової депресії. ЛПС в ранньому періоді його впливу (4,0 год з моменту введення, 0,1 мг/кг, в/очер) викликав практично у всіх тварин виразну експлозивність,  відведення задніх лап, зниження тонусу хвоста і больового порога, а також здатності утримувати позу «місток». У 19 із 25 щурів спостерігався птоз. Таким чином, ЛПС викликав послаблення опіат- обумовлених симптомів, виразність яких не змінювалась під впливом налоксону (1,0 і 10,0 мг/кг, в/очер).

У віддаленому періоді дії ЛПС (12,0 год з моменту введення препарату, 0,1 мг/кг, в/очер) в структурі постсудомного кіндлінгового синдрому спостерігалась виразна здатність до приведення передніх кінцівок,  экзофтальм мав місце у 21 із 25 щурів, задні лапи були приведені при піднятті тварини за хвіст, у 15 із 25 щурів був підвищеним тонус хвоста, спостерігалось чітке зниження больової чутливості. Провокація тестуючою дозою коразолу кіндлінгових судом за умов аналогічного використання ЛПС (0,1 мг/кг, в/очер) на тлі введення налоксону (10,0 мг/кг, в/очер) не приводило до виникнення симптомів з боку очей, передні та задні лапи були розставлені, знижувався тонус м’язів хвоста, а також зростала виразність больових реакцій у відповідь на зтиснення хвоста корнцангом.