Влияние пептидогликанов, тейхоевых кислот и липополисахаридов бактерий на метаболическую активность и апоптоз нейтрофилов и субпопуляций Т-лимфоцитов in vitro

Краткое содержание

У вступі обґрунтовано актуальність проблеми дисертаційного дослідження, сформульовано мету, завдання, об’єкт, предмет та методи дослідження. Висвітлено наукову новизну, теоретичне та практичне значення роботи. Наведені дані про особистий внесок здобувача, апробацію роботи, впровадження результатів дослідження, публікації.

В першому розділі, який складається з двох підрозділів, наведений аналітичний огляд наявних літературних даних щодо впливу структурних компонентів бактерій на апоптоз і метаболічну активність імунокомпетентних клітин.

Матеріал і методи дослідження. Нейтрофіли (142 культури), Т-хелпери/індуктори (146 культур) та цитотоксичні Т-супресори (139 культур) були виділені з периферійної крові 47 практично здорових донорів-чоловіків віком від 19 до 24 років за допомогою центрифугування на градієнті фіколу-верографіну за H.R. Recalde (1994). Роботу виконували у відповідності до існуючих біоетичних норм. ПГН та ТК одержували з клітинних стінок Staphylococcus aureus, ЛПС – з клітинних стінок Escherichia coli. ПГН, ТК та ЛПС отримували з культур бактерій, ізольованих від пацієнтів з хірургічною (в тому числі оториноларингологічною) патологією). Вивчення впливу на нейтрофіли і субпопуляції Т-лімфоцитів ПГН, ТК та ЛПС проводили при їх концентрації 10 та 100 мкг/мл в тест-середовищі протягом 6 та 24 год. Інтактні клітини не контактували з ПГН, ТК та ЛПС.

Розраховували індекс апоптозу (ІА) як кількість клітин с ознаками апоптозу на 100 клітин у зразку (%).Визначення кількості клітин зі специфічними маркерами апоптозу проводили методом непрямої імунної флуоресценції з використанням моноклональних антитіл CD95 та CD38 (попередньо верифікацію апоптозу проводили методом проточної цитометрії та морфологічним методом).

Визначення вмісту циклічних нуклеотидів (цАМФ і цГМФ) проводили радіоімунним методом (в 1 млн. клітин). Визначення вмісту АТФ, АДФ та АМФ в нейтрофілах та субпопуляціях Т-лімфоцитів проводили за методом Conh, Carter C.E. (1950). ЕЗ імунокомпетентних клітин розраховували за формулою: ЕЗ = ((АТФ) + 1/2(АДФ))/((АТФ) + (АДФ) + (АМФ)). У лізатах клітин визначали: вміст ДК, МДА, активність каталази та СОД. Значення інтегрального коефіцієнту К розраховували за формулою: К =  (ДК+МДА)/(каталаза+СОД).

Характер виявлених змін був проаналізований з використанням варіаційної статистики на ЕОМ.

Вплив ПГН, ТК та ЛПС на апоптоз нейтрофілів та субпопуляцій Т-лімфоцитів in vitro. Встановлено, що безпосередній контакт ПГН, ТК та ЛПС з нейтрофілами та Т-лімфоцитами посилює апоптоз вказаних клітин, при цьому ступінь виразності апоптозу залежить як від виду структурного компонента бактерій, виду клітин-мішеней, так і від концентрації та тривалості взаємодії ПГН, ТК та ЛПС з клітинами. Апоптогенна дія структурних компонентів бактерій мала прояв у збільшенні кількості апоптуючих клітин, а також у збільшенні кількості клітин, які експонують специфічні та неспецифічні маркери апоптозу, що у першому випадку свідчило про готовність даних клітин до реалізації апоптозної програми. Зі збільшенням діючих концентрацій структурних бактеріальних компонентів, а також зі збільшенням тривалості їх контакту з клітинами-мішенями відбувалось значне посилення апоптогенної дії. Найбільший рівень апоптуючих клітин реєстрували при концентраціях ПГН, ТК та ЛПС 100 мкг/мл та експозиції 24 год.

Серед усіх використаних структурних компонентів бактерій найменший апоптогенний потенціал мали ТК. Бактерійні ПГН та ЛПС мали більш високий апоптогенний потенціал порівняно з таким для ТК. Найбільша інтенсивність апоптозу нейтрофілів і, особливо, Т-лімфоцитів розвивалась під впливом ЛПС.

Зокрема, внесення до культур нейтрофілів ТК в концентрації 10 мкг/мл не викликало вірогідних змін показника ІА від аналогічного показника інтактних клітин. Значуще збільшення експонування рецепторів до моноклональних антитіл CD38 на цитоплазматичних мембранах нейтрофілів під впливом ТК було зареєстроване лише на 24 год. експерименту (в 1,19 разу). Кількість CD95+-нейтрофілів на 6 год. досліду виявилась вищою відповідного показника інтактних клітин в 1,15 разу, а на 24 год. – вищою в 1,18 разу (р<0,05 в обох випадках порівняння). Збільшення діючої концентрації ТК до 100 мкг/мл викликало суттєве збільшення кількості апоптуючих нейтрофілів. Так, на 6 год. експерименту значення ІА нейтрофілів виявилось у 1,28 разу вищим відповідного показника інтактних клітин та в 1,21 разу вищим аналогічного показника у досліді з ТК у дозі 10 мкг/мл. На 24 год. експерименту аналогічні розбіжності склали 1,42 та 1,4 разу відповідно (у всіх випадках порівняння розбіжності були вірогідними). Під впливом ТК у дозі 100 мкг/мл збільшувалась також кількість CD38+- та CD95+-нейтрофілів. На 6 год. досліду рівень CD38+-клітин перевищив показник інтактних нейтрофілів у 1,3 разу, на 24 год. – у 1,68 разу (р<0,001 в обох випадках); збільшення відносно аналогічних показників при використанні ТК у дозі 10 мкг/мл склало 1,21 та 1,4 разу відповідно. У той же час, кількість CD95+-нейтрофілів під впливом ТК у дозі 100 мкг/мл збільшилась на 6 та 24 год. експерименту проти відповідних показників інтактних клітин у 1,54 та в 1,8 разу відповідно. При цьому зареєстровані показники виявились у 1,35 та в 1,53 разу вищими, ніж це мало місце у досліді з ТК у дозі 10 мкг/мл.

Нами також встановлено, що найменш чутливою до апоптогенного впливу ПГН, ТК та ЛПС є субпопуляція цитотоксичних Т-супресорів, тоді як найбільшу чутливість до бактеріальних компонентів проявляла субпопуляція Т-хелперів/індукторів. Апоптозна реакція нейтрофілів при контакті з ПГН, ТК та ЛПС була дещо вищою, ніж у цитотоксичних Т-супресорів.

Так, зокрема, взаємодія цитотоксичних Т-супресорів з ТК у дозі 10 мкг/мл не супроводжувалась протягом 24 год. експерименту значущим збільшенням експресії рецепторів до моноклональних антитіл CD38 та CD95 на цитоплазматичних мембранах, на відміну від нейтрофілів та Т-хелперів/індукторів. На 24 год. досліду значення ІА в культурі CD8+-лімфоцитів вірогідно не відрізнялось від показника інтактних клітин та було нижчим аналогічних показників у дослідах з нейтрофілами та Т-хелперами/індукторами в 1,67 та в 2,76 разу відповідно (р<0,001 в обох випадках порівняння). Аналогічні розбіжності по експресії рецептора до моноклонального антитіла CD38 на CD8+-клітинах склали 1,55 та 2,06 разу, а по експресії рецептора до моноклонального антитіла CD95 – 2,4 та 3,4 разу (р<0,001 в обох випадках порівняння). Збільшення діючої концентрації ТК до 100 мкг/мл не викликало суттєвого збільшення значення ІА для цитотоксичних Т-супресорів на 6 та 24 год. експерименту відносно відповідних показників інтактних клітин. Разом з цим, зареєстровані значення ІА виявились значно нижчими таких для нейтрофілів та Т-хелперів/індукторів (на 6 год. досліду – у 1,6 та 3,1 разу, на 24 год. – у 2,2 та 4,8 разу). На 6 год. досліду питома вага CD38=-цитотоксичних Т-супресорів виявилась у 1,59 разу вищою показника інтактних клітин, та в 1,48 разу вищою аналогічного показника у досліді з ТК в дозі 10 мкг/мл. На 24 год. взаємодії цитотоксичних Т-супресорів з 100 мкг/мл ТК неспецифічний маркер апоптозу був виявлений у 23,9±1,2 % клітин (перевищення відповідного показника інтактних клітин склало 1,87 разу, перевищення показника у досліді з 10 мкг/мл ТК – 1,67 разу). Зареєстровані рівні CD38+-цитотоксичних Т-супресорів виявились, однак, нижчими таких для нейтрофілів та Т-хелперів/індукторів при аналогічних умовах досліду.

Часо-, дозо- та видозалежний вплив ПГН, ТК та ЛПС бактерій на апоптоз імунокомпетентних клітин, встановлений у нашій роботі, узгоджується з результатами досліджень, отриманих іншими авторами (Harrison L.M. et al., 2005; Acorci M.J. et al., 2009). Разом з цим, нами вперше було показано, що субпопуляція Т-хелперів/індукторів при безпосередньому контакті з ПГН, ТК та ЛПС відповідала найбільш інтенсивною активацією апоптозної програми, ніж це мало місце в субпопуляції цитотоксичних Т-супресорів. Відзначений феномен дозволяє пояснити, чому в процесі інфекційного захворювання бактеріальної етіології переважно формується супресорний варіант імунодефіциту, і чому останній посилюється зі збільшенням тривалості інфекційного процесу та максимальний при тяжкому перебігу останнього.

Вплив ПГН, ТК та ЛПС на систему циклічних нуклеотидів нейтрофілів та субпопуляцій Т-лімфоцитів in vitro. Нами встановлено, що ТК, ПГН та ЛПС при безпосередньому контакті in vitro з нейтрофілами та Т-лімфоцитами периферійної крові людини змінювали у даних клітинах вміст цАМФ та цГМФ, а також порушували їх баланс. Вплив бактерійних ТК, ПГН та ЛПС на систему циклічних нуклеотидів та Т-лімфоцитів залежав від дози структурних компонентів та часу їх взаємодії з клітинами, а спрямованість змін вмісту цАМФ та цГМФ була неоднаковою у різних клітин-мішеней. Найбільші зміни в системі циклічних нуклеотидів реєстрували на 24 год. експерименту при використанні структурних компонентів бактерій в концентрації 100 мкг/мл. Крім того, виразність та спрямованість змін вмісту циклічних нуклеотидів були різними у різних видів клітин периферійної крові людини. Під впливом структурних компонентів бактерій внутрішньоклітинний вміст цАМФ ц всіх видах клітин збільшувався. В той же час внутрішньоклітинний вміст цГМФ у популяціях нейтрофілів та Т-хелперів/індукторів зменшувався, тоді як в цитотоксичних Т-супресорах – збільшувався. Різноспрямовані зсуви цАМФ та цГМФ призводили до того, що значення коефіцієнта цАМФ/цГМФ для нейтрофілів та Т-хелперів/індукторів збільшувалось по мірі збільшення діючих концентрації та часу контакту з ними ТК, ПГН та ЛПС, тоді як в популяції цитотоксичних Т-супресорів значення коефіцієнта цАМФ/цГМФ знижувалось.

Отримані нами результати дослідження стану системи циклічних нуклеотидів у нейтрофілах та субпопуляціях Т-лімфоцитів під впливом структурних компонентів бактерію узгоджуються з такими, отриманими іншими авторами (Гайдаш І.С. та ін., 2001; Татаров С.В., 2003; Стериони И.В., 2008). Разом з цим, встановлена різноспрямованість змін внутрішньоклітинних концентрацій цАМФ та цГМФ у імунорегуляторних субпопуляціях Т-лімфоцитів під впливом ендотоксинів бактерій була раніше невідомою. Знання цього факту дозволяє патогенетично обґрунтовано використовувати фармакологічні препарати, які в основі своєї дії мають вибірковий вплив на внутрішньоклітинний вміст циклічних нуклеотидів.

Вплив ПГН, ТК та ЛПС на систему аденілових нуклеотидів нейтрофілів та субпопуляцій Т-лімфоцитів in vitro. Нами встановлено, що ПГН, ТК та ЛПС бактерій при 6 та 24 год. контакту з нейтрофілами та Т-лімфоцитами периферійної крові людини in vitro знижують у цих клітинах вміст АТФ та збільшують вміст АДФ та АМФ, що супроводжується зменшенням значення інтегрального показника ЕЗ. Зміни у системі аденілових нуклеотидів під впливом вказаних структурних компонентів бактерій носять дозо- та часозалежний характер, а також розрізняються за ступенем виразності у різних клітин-мішеней. Найбільшу чутливість аденілової системи до дії бактерійних ПГН, ТК та ЛПС проявляли CD4+-клітини, найменшу – цитотоксичні Т-супресори та нейтрофіли.

Зокрема, контакт нейтрофілів з ТК у концентраціях 10 та 100 мкг/мл протягом 6 та 24 год. не викликав суттєвої зміни значення ЕЗ порівняно з відповідним показником інтактних клітин. Вплив на нейтрофіли ПГН в концентраціях 10 та 100 мкг/мл до 24 год. експерименту не призводив до вірогідного зниження значення ЕЗ даних клітин. На 24 год. контакту нейтрофілів з ЛПС у дозі 10 мкг/мл ЕЗ виявився в 1,05 разу нижчим відповідного показника інтактних клітин (р>0,05). Збільшення дози ЛПС до 100 мкг/мл викликало в нейтрофілах найбільш значні зміни в аденіловій системі, що було виявлено вже на 6 год. досліду. Значення ЕЗ склало 0,78±0,03 у.о., що було нижче показника інтактних клітин у 1,06 разу (р>0,05) та вірогідно не відрізнялось від значень ЕЗ, зареєстрованих у досліді з іншими структурними компонентами бактерій.

Співставлення значень ЕЗ, зареєстрованих нами у дослідах з цитотоксичними Т-супресорами та ТК, ПГН і ЛПС, з аналогічними показниками у дослідах з нейтрофілами, не дозволило виявити суттєвих розбіжностей, що свідчить про схожу чутливість їх аденілових систем до впливу структурних компонентів бактерій.

Найбільші порушення вмісту аденілових нуклеотидів під впливом ТК, ПГН та ЛПС бактерій спостерігали в субпопуляції Т-хелперів/індукторів. Зокрема, ЕЗ CD4+-лімфоцитів, зареєстрований на 24 год. досліду з 100 мкг/мл ПГН, виявився у 1,14 разу (р<0,05) нижчим, ніж в аналогічному досліді з нейтрофілами, і в 1,09 разу (р>0,05) нижчим, ніж у досліді з цитотоксичними Т-супресорами. ЕЗ, зареєстрований на 24 год. досліду Т-хелперів/індукторів з 100 мкг/мл ЛПС, не відрізнявся від такого у досліді з ПГН у дозі 100 мкг/мл, але був у 1,08 разу нижчим (р>0,05), ніж в експерименті з ТК у дозі 100 мкг/мл.

Отримані нами результати узгоджуються з даними інших авторів, які також відзначили негативні зсуви у енергетичному забезпеченні клітин як під впливом бактеріальних ендотоксинів, так і під дією інших несприятливих для соматичних клітин факторів (Татаров С.В., 2004; Миргородская А.В., 2007).

Вплив ПГН, ТК та ЛПС на стан процесів ПОЛ та активність ферментів системи АОЗ в нейтрофілах та субпопуляціях Т-лімфоцитів in vitro. Вплив ПГН, ТК та ЛПС бактерій на нейтрофіли та субпопуляції Т-лімфоцитів супроводжувався посиленням ПОЛ в даних клітинах, проявом чого було збільшення внутрішньоклітинного вмісту проміжних (ДК) та кінцевого (МДА) продуктів ПОЛ. Поряд з цим, спостерігали зниження активності внутрішньоклітинних ферментів системи АОЗ – каталази та СОД, що свідчило про функціональну недостатність даної системи. Прооксидантна дія бактеріальних ендотоксинів носила видо-, дозо- та часозалежний характер. Найбільший прооксидантний вплив на імунокомпетентні клітини мали ПГН та ЛПС, найменший – ТК. Зі збільшенням діючої концентрації бактеріальних ендотоксинів, а також часу їх взаємодії з клітинами-мішенями, зміни ПОЛ та ферментативної системи АОЗ зростали. Найбільш чутливими до прооксидантної дії ТК, ПГН та ЛПС були Т-хелпери/індуктори, найменш чутливими – цитотоксичні Т-супресори.

Так, зокрема, у досліді з нейтрофілами та 10 мкг/мл ТК значення коефіцієнта К на 6 та 24 год. виявилось у 1,17 та у 1,3 разу вищим, ніж у інтактних клітин (р<0,05 и р<0,001), а у досліді з 100 мкг/мл ТК – в 1,191 та у 2,0 рази (р<0,001 в обох випадках порівняння). У дослідах з 10 та 100 мкг/мл ПГН та нейтрофілами аналогічні розбіжності склали 1,35, 1,94, 1,5 та 1,99 разу (розбіжності вірогідні у всіх випадках). Зареєстровані значення коефіцієнту К для нейтрофілів при використанні ЛПС у дозах 10 та 100 мкг/мл у переважній більшості випадків вірогідно від таких у дослідах з ПГН не відрізнялись. Виняток склало значення коефіцієнта К на 6 год. досліду з 10 мкг/мл ЛПС, яке виявилось у 1,13 разу вищим такого в досліді з ПГН при інших рівних умовах досліду.

Отримані нами дані узгоджуються з результатами, отриманими іншими дослідниками, які також відзначили активацію процесів ПОЛ та недостатність ферментативної системи АОЗ у імунокомпетентних клітинах під впливом структурних компонентів умовно-патогенних бактерій (Коновалов А.Ю., 2007; Миргородская А.В.; 2007). Однак встановлена нами різна чутливість субпопуляцій Т-лімфоцитів до прооксидантного впливу бактеріальних ендотоксинів є раніше невідомим фактом, як і дані порівняльної характеристики прооксидантної реакції нейтрофілів та субпопуляцій Т-лімфоцитів.

Таким чином, результати дослідження, подані в нашій роботі, свідчать про те, що структурні компоненти умовно-патогенних бактерій – ПГН, ТК та ЛПС є біологічно активними сполуками, які здатні при безпосередньому контакті з нейтрофілами та субпопуляціями Т-лімфоцитів стимулювати апоптоз даних клітин та порушувати їх метаболічний статус. Негативний вплив вказаних бактеріальних ендотоксинів є видоспецифічним, дозо- і часозалежним, і найбільш виразно реалізується в субпопуляції Т-хелперів/індукторів порівняно з таким у цитотоксичних Т-супресорах та нейтрофілах.

Отримані нами дані дозволяють пояснити причину переважного формування супресорного варіанта імунодефіциту при розвитку різних інфекційних процесів бактеріальної етіології, а також є підставою для розробки цілеспрямованої патогенетично обґрунтованої фармакологічної корекції апоптозних і метаболічних змін в імунокомпетентних клітинах.

ВИСНОВКИ

В дисертації подане теоретичне обґрунтування ролі структурних компонентів бактерій (ПГН та ТК Staphylococcus aureus та ЛПС Escherichia coli) в стимуляції апоптозу та метаболічних порушень нейтрофілів, Т-хелперів/індукторів та цитотоксичних Т-супресорів периферійної крові здорових людей in vitro, та доведена залежність цієї ролі від концентрації ТК, ЛПС і ПГН, а також від часу експонування клітин з структурними компонентами бактерій.

1.         Структурні компоненти бактерій (ПГН, ТК та ЛПС) в діючих концентраціях 10 та 100 мкг/мл та при експозиції до 24 год. in vitro стимулюють апоптоз нейтрофілів, Т-хелперів/індукторів та цитотоксичних Т-супресорів, що має прояв у збільшенні кількості клітин з морфологічними ознаками апоптозу, а також кількості клітин з маркерами апоптозу СD38 та CD95. Стимулююча апоптоз дія структурних компонентів бактерії є дозо-, часо- та видозалежною. Зі збільшенням діючої концентрації ПГН, ТК та ЛПС, а також тривалості їх контакту з клітинами-мішенями кількість апоптуючих клітин збільшується. Найбільший апоптогенний потенціал мають ПГН та ЛПС, найменший – ТК. Найбільш чутливими до апоптогенного впливу ПГН, ТК та ЛПС є Т-хелпери/індуктори, помірно чутливим є нейтрофіли, найменш чутливими – цитотоксичні Т-супресори периферійної крові людини.

2.         ПГН, ТК та ЛПС бактерій при контакті з нейтрофілами, CD4+- та CD8+-лімфоцитами in vitro змінюють внутрішньоклітинний вміст цАМФ, цГМФ та їх баланс. Нейтрофіли та CD4+-лімфоцити при контакті з ТК, ПГН та ЛПС реагують збільшенням вмісту цАМФ та зниженням цГМФ, тоді як в CD8+-лімфоцитах збільшення цГМФ переважає над збільшенням цАМФ. Вплив ТК, ПГН та ЛПС на систему циклічних нуклеотидів нейтрофілів, CD4+- та CD8-лімфоцитів є видо-, дозо- та часозалежним.

3.         ТК, ПГН та ЛПС при контакті з нейтрофілами, CD4+- та CD8+-лімфоцитами знижують ЕЗ цих клітин за рахунок зменшення внутрішньоклітинного вмісту АТФ і збільшення вмісту АДФ та АМФ. Вплив ТК, ПГН та ЛПС на систему аденілових нуклеотидів нейтрофілів, CD4+- та CD8+-лімфоцитів є видо-, дозо- та часозалежним: зі збільшенням концентрації та часу взаємодії структурних компонентів бактерій з клітинами-мішенями в останніх зміни в системі аденілових нуклеотидів збільшуються. Потенціал впливу на систему аденілових нуклеотидів у ПГН та ЛПС вищий такого у ТК. Найзначніше зниження ЕЗ під впливом ТК, ПГН та ЛПС розвивається в Т-хелперах/індукторах, найменше – в нейтрофілах.

4.         ТК, ПГН та ЛПС при контакті з нейтрофілами, CD4+- та CD8+-лімфоцитами in vitro активують в них ПОЛ та знижують активність каталази та СОД. Прооксидантна дія структурних компонентів бактерій залежить від їх виду, дози, а також від часу взаємодії з клітинами. Прооксидантна дія найбільш виражена у ЛПС та ПГН, та найменш виражена у ТК. Зі збільшенням діючої концентрації ТК, ПГН та ЛПС та часу їх контакту з нейтрофілами, CD4+- та CD8+-лімфоцитами порушення процесів ПОЛ і активності ферментів системи АОЗ у цих клітинах посилюються. Найбільш чутливими до проокисдантного впливу ТК, ПГН та ЛПС є Т-хелпери/індуктори, найменш чутливими – цитотоксичні Т-супресори.