СОХРАННОСТЬ ЭКСТРАКТА ПЛАЦЕНТЫ НА ЭТАПАХ НИЗКОТЕМПЕРАТУРНОГО ХРАНЕНИЯ И ЕГО ЭФФЕКТИВНОСТЬ ПРИ УРОГЕНИТАЛЬНЫХ РАССТРОЙСТВАХ У ЖЕНЩИН В КЛИМАКТЕРИИ

Краткое содержание

Матеріали і методи досліджень. Для вирішення поставлених задач нами був вивчений гормональний склад препарату «Кріоцел-кріоекстракт плаценти». Препарат є кріоконсервованим кріоекстрактом плаценти на фізіологічному розчині, отриманий після дрібнодисперсної фрагментації тканини плаценти, розфасований в одноразові контейнери по 1,5 мл. Вміст в кріоекстракті гормонів - ФСГ і ЛГ, пролактина, естрадіола, тестостерона, прогестерона, кортизола визначали методом твердофазного імуноферментного аналізу, з використанням готової тест-системи «Алькор-біо» (СПб, Росія). Всі абсолютні величини вмісту гормонів, що визначалися в кріоекстракті плаценти, пронормували на концентрацію білка в пробі. Вміст загального білка визначали уніфікованим методом за біуретовою реакцією. Концентрацію гормонів в екстракті плаценти оцінювали після переносу його з рідкого азоту до інших  умов зберігання (режими зберігання): I – 1 доба +4ºС; II– 10 діб -20ºС; III – 10 діб -20ºС, потім 1 рік при -196ºС; ІV – 1 рік при -20ºС. Вибір режимів визначався необхідністю зберігання кріоекстракту плаценти в умовах клініки без використання рідкого азоту. Контролем був кріоекстракт плаценти відразу після відігрівання на водяній бані при t +37ºС, заготований відповідно до методики отримання препарату «Кріоцел-кріоекстракт плаценти».

Для вивчення біологічної активності препаратів плаценти був проведений експеримент на лабораторних тваринах. Робота виконана на 28 старих (більш двох років) самках щура лінії Аугуста масою 180-200 г і 7 молодих (до 1 року) щурах масою 200-220 г. (для більш точної оцінки впливу препарата треба було взяти великих 2-кольорових щурів).

Тварини були розділені на 5 експериментальних груп:

І група – молоді інтактні тварини (n=7);

ІІ група інтактних старих тварин служила контролем (n=7);

ІІІ групу складали старі щури, яким протягом 5-ти днів 1 раз на добу внутрішньом'язово вводили кріоекстракт людської плаценти з розрахунку 0,1 мл на 100 г маси тварини (n=7);

ІV групу складали старі тварини, яким під місцевою новокаїновою анестезією в області стегна була проведена підшкірна підсадка кріоконсервованного фрагмента плаценти, заготованої відповідно до методики отримання  цього препарату (n=7);

V група складалася з тварин, яким під ефірним наркозом була проведена лапаротомія з двосторонньою аднексектомією. Через 21 добу після кастрації тваринам так само, як і щурам ІІІ групи, вводили кріоекстракт плаценти (КЕПл) за аналогічною методою (n=7).

Перед початком експерименту щодня протягом тижня у всіх груп тварин для контролю естрального циклу брали мазки з подальшим пофарбуванням їх метиленовою синню. Після експерименту у тваринах перших чотирьох груп взяття мазків повторювалося.

Через 4 тижні після дослідження тварин виводили з експерименту за допомогою декапітації.

Кров з шийної вени досліджували на зміст гормонів – естрадіола, прогестерона і 11-ОКС. Вся робота с тваринами проводилась  згідно з  положенням IV Европейскої Конвенціі (ETS 123, 1986) по захисту хребтових тварин, використаних для експериментальних та інших наукових  цілей, протоколи експериментів розглянуті комітетом з біоетики при ІПКіК  НАН України. Гормони визначали методом твердофазного імуноферментного аналізу з використанням готової тест-системи «Алькор-біо» (СПб, Росія).

Для гістологічного дослідження брали кісткову тканину (стегнову кістку), а також тканини надниркових, щитовидної залози, яєчників і матки, оскільки саме в цих органах особливо виражені

інволютивні зміни в старечому віці. Фрагменти органів фіксували в 10%-ному нейтральному формаліні з подальшою заливкою в парафін. Отримані з парафінових блоків зрізи завтовшки в 6-8 мікрон фарбували гематоксиліном і еозином для отримання оглядових гістологічних препаратів.

Для визначення терапевтичної ефективності кріоекстракту при урогенітальних розладах в клімактеричному періоді у жінок було проведено  клінічне дослідження.

В дослідженні брали участь 45 жінок від 45 до 79 років. Середній вік настання менопаузи 47,9 ±3,5 років. Всі хворі, що брали участь в дослідженні, були розділені на дві групи. Розподіл хворих за віком, тривалістю захворювання, клінічним даним та результатам додаткових досліджень було аналогічним в обох групах (р<0,05).

До першої увійшло 20 жінок з клінічними виявами урогенітальних розладів у віці від 45 до 79 років (середній вік 61,0 ± 7,6), які для лікування застосовували вагінальні свічки «Овестін» фірми «Органон», Нідерланди.

До другої групи увійшло 25 жінок у віці від 49 до 79 років (середній вік 61,1 ± 7,4), з аналогічними скаргами, яким була призначена комплексна терапія: препарат «Кріоцел-кріоекстракт плаценти» у вигляді внутрішньо м’язових ін'єкцій 1,5 мл через два дні на третій, на курс 5 ін'єкцій, з одночасним введенням вагінальних тампонів, просочених цим препаратом.

До контрольної групи входили 25 жінок у віці від 45 до 70 років без яких-небудь виявів патологічного клімаксу.

До призначення лікування всім пацієнткам проводилася пальпація молочних залоз, регіональних лімфовузлів, щитовидної залози, проводився огляд шийки матки за допомогою дзеркал, а також бімануальне дослідження. З метою об'єктивної оцінки стану хворих обох груп до і через 1 тиждень після лікування була проведена оцінка комплексу кількісних і якісних показників: проведено анкетування обстежуваних жінок (на основі розроблених нами анкет), проводилося бактеріологічне обстеження вмісту піхви, шляхом посіву виділень з піхви, цервикального каналу і уретри на селективні живильні середовища, кольпоскопічне, цитологічене, кольпоцитологічне дослідження, рН-метрія вагінального вмісту, амінотест. Результати анкетування також оброблялися статистично з метою визначення середнього показника ступеня тяжкості захворювання в досліджуваній групі хворих, виходячи з передумови, що 2–3 бала відповідає легкому ступеню захворювання, 3–6 – середньому і 6–9 – важкому ступеню захворювання. Для кольпоцитологічного дослідження фіксований етиловим спиртом і пофарбований 1 % водним розчином фуксина кислого мазок спочатку вивчався під малим збільшенням мікроскопа, а потім з імерсією. Оцінювали морфологію клітин епітелію піхви, робили підрахунок клітин з пікнозом ядра і зруйнованою цитоплазмою, проводили визначення каріопікнотичного індексу (КПІ). рН-метрія проводилася за допомогою паперових тестів фірми «Лахема», Чехословакія. Амінотест проводився з використанням 10%-ого розчину KOH для діагностики бактеріального вагіноза. В описі результатів аналізу амінотеста приведений процентний вміст хворих з позитивним тестом в досліджуваній групі.

Матеріалом для бактеріологічного  дослідження також було  слизисте виділення піхви хворих жінок сенильним кольпітом і нормоценозом, узяте відповідно до інструктивних матеріалів і методичних рекомендацій МОЗ СРСР та МОЗ України за методами мікробіологічних досліджень в клініко-діагностичних лабораторіях до та після лікування.

Кольпоскопічне дослідження проводилося всім жінкам в кабінеті патології шийки матки за допомогою кольпоскопа МК-300.

Статистична обробка матеріалу проведена загальноприйнятими методами за t критерієм Стьюдента-Фішера.

Результати власних досліджень. В результаті проведених нами досліджень встановлено, що короткотривале низькотемпературне зберігання (10 діб.) екстракту плаценти при температурі ‑ 20°C не приводить до істотної втрати гормональної складової препарату, що дуже спрощує використання і зберігання препарату в умовах клінічних установ. Подальше глибоке заморожування, тривале (до 1 року) зберігання при температурі рідкого азоту (‑196ºС) достовірно не приводить до зміни змісту гормонів в екстракті. Тривале (до 1 року) зберігання кріоекстракта в умовах морозильної камери -20^оС не бажано і приводить до зменшення змісту гормонів в препараті, а зберігання екстракту в умовах побутового холодильника (+4^оС) приводить до істотного зниження рівня всіх гормонів. (див. табл.1).

ФСГ та ЛГ глікопротеїни подібної структури, являють собою димери з двох різних субодиниць, пов’язаних нековалентно, з молекулярною масою 30кДа, які легко дисоціюють при зміні властивостей середовища. Обидва мають вуглеводну частину, що складає приблизно 15% від їх молекулярної маси. Оскільки вміст гормонів у розчині визначалось методом ІФА, можливо, в процесі заморожування і концентрування розчинів при вимерзанні води створюються умови, які порушують структуру цих білків і змінюють їх взаємодію з імуноферментними мітками. Зниження вмісту пролактину після зберігання протягом доби при +4ºС, як і зниження вмісту ЛГ та ФСГ, можна пояснити дією протеолітичних ферментів. Вміст тестостерону змінюється в кріоекстракті плаценти при низькотемпературному зберіганні аналогічним чином: найбільш пошкоджуючим є використання режимів І (зберігання 1 добу при +4^оС) і ІV(1 рік при -20^оС), але навіть при самому глибокому охолодженні кількість тестостерону не знижується нижче 60% від вихідного рівня. Активність тестостерону зумовлена реакційною ОН-групою, яка є рецептором при імуноферментному аналізі. Подібним чином низькотемпературне зберігання впливає на вміст прогестерону та кортизолу, для них також найбільш пошкоджуючим є використання режимів I і ІV. При переносі кріоекстракта плаценти з рідкого азоту до інших умов зберігання здійснюється нагрів досліджуючого  препарату. На нашу думку, цей температурний вплив приводить до додаткового зруйнування структури гормонів та до зменшення  їх змісту.