СИСТЕМА ПРОТЕОЛІЗУ І ГЛІКОЗИЛЮВАННЯ ІМУНОГЛОБУЛІНІВ G В ПАТОГЕНЕЗІ ЗЛОЯКІСНИХ НОВОУТВОРЕНЬ (клініко-лабораторне дослідження) : СИСТЕМА протеолиза И гликозилирования ИММУНОГЛОБУЛИНОВ G В ПАТОГЕНЕЗЕ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ Образовавшаяся (клинико-лабораторное исследование)

Краткое содержание

Матеріал  і  методи  дослідження. Контрольну групу здорових людей склали 50 осіб  – донорів-добровольців з Кримської республіканської станції переливання крові. Для дослідження сироваткової активності протеїназ-інгібіторної системи і стійкості сироваткового IgG до трипсинового гідролізу об'єктом досліджень були вибрані хворі з онкопатологією шлунка, які проходили обстеження і лікування в Кримському республіканському клінічному онкологічному диспансері. В основну групу досліджень були включені 94 первинних хворих на РШ. Після постановки кінцевого діагнозу хворі були розподілені на дві групи. До першої (45 осіб) увійшли пацієнти з РШ, які не мають ознак віддаленого метастазування. Друга група складалася з 49 осіб, до неї ввійшли пацієнти з 4-ою стадією розвитку захворювання з ознаками віддаленого метастазування. У сферу наших досліджень були включені також два пацієнти з рідкісною формою доброякісної пухлини – лейоміомою шлунку, а також п'ять хворих з рецидивами РШ. Наступна серія досліджень включала 60 хворих на ММ, які проходять лікування у відділенні гематології Кримського республіканського клінічного онкологічного диспансеру. Дослідження активності протеїназ-інгібіторної системи проводилося у 20 хворих на ММ; у 40 пацієнтів з ММ (29 хворих з парапротеїном класу IgG і 11 – класу IgA) визначали глікозилювання парапротеїнів і їх поведінку в електричному полі. Для аналізу впливу гіперглікемії і некрозу тканин на глікозилювання IgG були досліджені 10 хворих  на ЦД 2-го типу без ознак гострої коронарної патології, п'ять хворих на ІМ з характерним “інфарктним” зубцем Q у поєднанні з ЦД 2 типу (ІМ+ ЦД) і 5 хворих на ІМ без порушень вуглеводного обміну.

Загальну ТПА сироватки крові визначали за швидкістю розщеплювання N-альфа-бензоіл-L-аргініну ефіру (БАЕЕ) (Пасхина Т. С., Доценко В. Л., Блинникова Е. И., 1973). Оцінка ЕПА проводилася за гідролізом субстрату N-бутилоксикарбоніл-L-аланін-n-нітрофенілового ефіру (Оглоблина О. Р. та співав., 1980). Антитриптичну активність сироватки крові вивчали за методом, який грунтується на пригніченні інгібіторами, що містяться в сироватці крові (перш за все, ААТ), активності трипсину, залишкові значення якої вимірювали за розщеплюванням БАЕЕ; активність АМГ знаходили за рівнем розщепленого БАЕЕ трипсином, що зв'язався з АМГ, і подальшою інактивацією трипсину, що не зв'язався з АМГ, соєвим інгібітором трипсину (Нартикова В. Ф., Пасхина Т. С., 1979).

Поліклональні імуноглобуліни G і парапротеїни для аналізу їх глікозилювання отримували методом висолювання та іонообмінної хроматографії на ДЕАЕ-Трісакрілі М (LKB, Швеція) і ДЕАЕ А-50 (Pharmacia, Швеція); клас парапротеїнів і тип їх легких ланцюгів, а також тип білків Бенс-Джонса (Б-Дж) – легких ланцюгів парапротеїнів, що виявляються в сечі хворих на ММ, – визначали методами імуноелектрофорезу і подвійною радіальною імунодифузією за Оухтерлоні (Фримель Р., 1987). Як контроль використовували поліклональний IgG, виділений з суміші сироваток крові п'ятдесятьох здорових людей.

Порівняльна оцінка рухливості парапротеїнів в електричному полі, яка грунтується на аналізі їх молекулярної маси і заряду, проводилася методом диск-електрофорезу в 7,5% ПААГ (PAGE) і в градієнті концентрації ПААГ (3,5-30%) в SDS-PAGE (Гааль Э., Медьеши Р., Верецкеи Л., 1982).

ЛФА, що реєструє ступінь глікозилювання IgG, проводився за допомогою розробленої нами методики (Петросян А. М., Британ А. В., 2006). У дослідженнях переважно застосовувався лектин гороху (Pisum sativum, PSA), що володіє високою спорідненістю до a-D-Man і менш вираженою (у 2 рази) – до a-D-глюкози (Лобсанов Ю. Д., Плетнев В. З., Мокульский М. А., 1990). Також використовували лектин картоплі (Solanum tuberosum, STA, специфічність до b-GlcNAc), лектин арахісу (Arachis hypogaea, PNA, специфічність до b-Gal), лектин пшениці (Triticum vulgaris, WGA, специфічність до NeuAc (glcNAc) ₂), і лектин виноградного равлика (Helix pomatia, HPA, специфічність до a-GalNAc). Трипсиновий гідроліз проб IgG проводили при співвідношенні фермент: субстрат рівному 1:50 (w/w); тривалість гідролізу при +37°С склала 16 годин, після чого реакцію розщеплювання імуноглобулінів припиняли соєвим інгібітором трипсину в співвідношенні трипсин/інгібітор 1:2 (w/w) (Фримель Р., 1987).

Статистична обробка даних проводилася за допомогою пакету програм Microsoft Excel (Windows XP). Дані представлені у вигляді M ± m. Відмінності оцінювалися за критерієм Стьюдента t і вважалися достовірними при р<0,05. Аналіз кореляції між абсолютними параметрами оцінювався за коефіцієнтом лінійної кореляції Пірсона r, кореляція вважалася достовірною при р<0,05 (Лапач З. Н., Чубенко А. В., Бабич П. Н., 2001). Аналіз відносних величин проводився з урахуванням критичних значень коефіцієнтів кореляції рангів Спірмена r. Пошук пов'язаності двох різних показників проводився за допомогою критерію узгодженості Пірсона c², а також коефіцієнта пов'язаності Чупрова К і коефіцієнта асоціації Юла Q (Зайцев В. М., Лифляндский В. Р., Маринки В. В., 2003).

Результати власних досліджень та їх обговорення. Наші дослідження щодо активності компонентів системи протеолізу дозволили зробити висновок, що при розвитку РШ відбуваються значні зрушення як з боку системи протеїназ, так і їх інгібіторів. Так, ТПА була понижена у хворих без віддаленого метастазування на 33,3%