ВИВЧЕННЯ БІОХІМІЧНИХ ПРОЦЕСІВ У ГЕПАТОЦИТАХ КОРОПА І РАКА ЗА ДІЇ ПОШКОДЖУЮЧИХ ЧИННИКІВ СЕРЕДОВИЩА : ИЗУЧЕНИЯ БИОХИМИЧЕСКИХ процессов в гепатоцитах карпа и РАКА ЗА ДЕЙСТВИЯ повреждающим факторам СРЕДЫ

Краткое содержание

Огляд літератури. Проаналізовано сучасну інформацію про молекулярні механізми адаптації водних тварин. Дається характеристика сучасним уявленням про оксидативний стрес, гострофазну відповідь та метаболічні адаптації в гепатоцитах як прояви клітинного стресу. В результаті аналізу встановлено, що наявні дані розрізнені й недостатні для визначення участі гепатоцитів прісноводних тварин в адаптації організму до дії пошкоджуючих чинників. Очевидною є необхідність формування інтегрального набору біохімічних показників стану антистресорних систем прісноводних тварин.

Матеріали та методи дослідження. Дослідження проводили на коропі лускатому (Cyprinus carpio L.) дворічного віку масою 200–250 г (120 екземплярів) та дорослих особинах рака вузькопалого (Astacus leptodactylus Eschscholtz) масою (50±5) г та довжиною тіла (10±1) см (48 екземплярів).

Досліди на тваринах виконували із дотриманням ухвали Першого національного конгресу з біоетики про захист хребетних тварин, які використовуються для експериментальних та наукових цілей (Київ, 2001). Комісія з біоетики Тернопільського  державного медичного університету імені І.Я. Горбачевського  (протокол №  14 від 18            жовтня 2007 р. ) порушень морально-етичних норм при проведенні науково-дослідної роботи не виявила.

У кожному  досліді одна група була контрольною, а в іншій у воду додавали солі важких металів або фенол. Для дослідження використовували іони металів, які є поширеними забруднювачами прісних водойм України. Найнижчі із створених нами модельних концентрацій чинників відповідають 0,1 рибогосподарських ГДК та діапазону їх екологічно реальних концентрацій у прісних водоймах України (Линник П.Н., 1999). У коропа досліджували також у 20 і 50 разів вищі концентрації іонів металів (відповідно 2 ГДК і 5 ГДК). За умов індивідуальної дії вміст у воді Cu²⁺ (CuSO₄) в розрахунку на катіон складав 0,01, 0,2 або 0,5 мг/л; Zn²⁺ (ZnSO₄) – 0,1, 2,0 або 5,0 мг/л; Mn²⁺ (MnCl₂) – 0,13, 2,6 або 6,0 мг/л; Pb²⁺ (Pb(NO₃)₂) – 0,01, 0,2 або 0,5 мг/л, фенолу – 0,002 мг/л. При дослідженні дії суміші іонів вміст компонентів становив Cu²⁺ – 0,01 мг/л, Zn²⁺ – 0,1 мг/л, Mn²⁺ – 0,13 мг/л, Pb²⁺ – 0,01 мг/л.

Протягом експерименту вміст металу контролювали за допомогою атомно-абсорбційної спектроскопії. Застосовувані концентрації не призводили до летального кінця протягом 14 діб утримання. Відповідний вміст аніонів у воді був на один або два порядки нижчим, ніж їх дозволений вміст у рибогосподарських водоймах та вміст у водопровідній воді, й не призводив до осадження солей за їх внесення в акваріум у суміші. Період утримання тварин становив 14 діб.

Для аналізу використовували передню частку печінки коропа і гепатопанкреас рака. Всі процедури з виділення та обробки зразків проводились на холоді. Для визначення біохімічних показників готували     10 %-ний гомогенат тканини у 10 мМ трис-HCl буферному розчині, рН 7,4.

Стан антиоксидантних систем організму характеризували за активністю антиоксидантних ферментів та утворенням продуктів пероксидації ліпідів. До антиоксидантних факторів відносили активність супероксиддисмутази (СОД) [КФ 1.15.1.1], каталази (КАТ) [КФ 1.11.1.6], вміст відновленого глутатіону (GSH), а до прооксидантних − вміст кінцевих продуктів пероксидного окиснення ліпідів (ПОЛ), який визначали при їх взаємодії з тіобарбітуровою кислотою (ТБК-активні продукти, ТБК-АП).

Активність СОД оцінювали за зниженням швидкості відновлення нітротетразолію синього в присутності феназинметасульфату і NADH (Чевари С. и соавт., 1991), КАТ − за здатністю пероксиду гідрогену утворювати з солями молібдену стійкий забарвлений комплекс         (Королюк М.А. і співавт., 1988). Вміст глутатіону (GSH і загального глутатіону) в тканині визначали неферментативно за реакцією з 5,5-дитіобіс-2-нітробензойною кислотою. Для визначення загального вмісту глутатіону дисульфідні зв’язки відновлювали за допомогою NaBH₄ у 8 М сечовині (Habeeb A.F.S., 1973). Вміст окисненого глутатіону (GSSG) обчислювали як різницю вмісту загального глутатіону і GSН, редокс-індекс глутатіону, РІ GSH − як співвідношення ([GSH]+2[GSSG])/2[GSSG]. Визначали вміст ТБК-АП у гомогенаті тканини (Стальная И.Д., Гаришвили Т.Г., 1977) та їх утворення за спонтанної інкубації гомогенату та за активації ферментного або неферментного ПОЛ, а також індекс антиоксидантної активності (ІАА) як показник впливу концентрації гомогенату на ПОЛ (Мартынюк В.Б. и соавт., 1991). Гомогенати інкубували 30 хв. при 25 ^оС: для визначення інтенсивності спонтанного ПОЛ – без доданків. Інкубаційна суміш для визначення неферментного ПОЛ містила 80 мМ аскорбінової кислоти, 0,2 мМ АDP, 0,012 мМ FeSO₄, а ферментного ПОЛ – замість аскорбінової кислоти 0,5 мМ NADPH.

Для характеристики гострофазної відповіді визначали вміст молекул середньої маси (МСМ) за інтенсивністю світлопоглинання небілкового екстракту тканини при 254 нм і 280 нм (Туряница И.М. и соавт.., 1991). Гепатотоксичність досліджуваних чинників оцінювали за активністю лужної фосфатази (ЛФ) [К.Ф. 3.1.3.1] та γ-глутамілтранспептидази [К.Ф. 2.3.2.2], які визначали із застосуванням наборів реактивів “Біо–ЛА–Тест” (Lachema, Чеська Республіка) відповідно до інструкцій фірми виробника. Вміст заліза, магнію, неорганічного фосфату та залізозв’язувальну здатність (ЗЗЗ) визначали за допомогою наборів реактивів “Біо–ЛА–Тест” (Lachema, Чеська Республіка). Загальний вміст білків у гомогенаті тканини визначали методом Lowry O.H. et al. (1951), використовуючи як стандарт сироватковий альбумін після їх осадження НСlО₄, відмивки і розчинення в 0,5 н КОН.

Результати визначення показників подавали у вигляді M±m, де n=5. За результатами обчислювали коефіцієнт антиоксидантного стану (КАС) як відношення сум показників стану антиоксидантного (А) і прооксидантного (П) статусу: КАС = Σ А/Σ П. Для уніфікації одиниць вимірів різних показників кожний з них обчислювали за формулою: 1 ± (М_д – М_к)/М_к, де 1 – характеристика показника в нормі, М_д і М_к – середньоарифметичні значення показників дослідної і контрольної серій відповідно. До “А” відносили такі показники як активність СОД і КАТ та вміст GSH в тканині, до “П” – вміст ТБК-АП. Статистичну обробку експериментальних даних здійснювали за Г.Ф. Лакіним (1990). Вірогідною вважали відмінність між рядами при р<0,05. Порівняльний аналіз біохімічних показників проводили з використанням пакета дисперсійного аналізу Anova, кореляційного тесту Пірсона (відмінності вірогідні при p<0,05), а також Принципового компонентного аналізу (Principal component analysis, ПКА), застосотовуючи комп’ютерні програми Statistical Analysis System (SPSS), Statistica v5.5 та Exell для Windows-2000.