ХІМІКО-ТОКСИКОЛОГІЧНЕ ДОСЛІДЖЕННЯ ЛЕПОНЕКСУ : Химико-токсикологические ИССЛЕДОВАНИЯ лепонекса

Краткое содержание

Для ідентифікації лепонексу в фармацевтичному аналізі використовують методи УФ-, ІЧ-спектроскопії, ТШХ, ГРХ, ВЕРХ, якісні реакції та деякі інші.

Безпосереднє використання цих методів та реакцій не завжди можливе у хіміко-токсикологічному аналізі. Деякі з них недостатньо чутливі та специфічні. Інші потребують попереднього ретельного очищення витяжок з біологічного матеріалу від співекстрактивних речовин, які заважають ідентифікації. Тому в хіміко-токсикологічному аналізі проводять комплекс досліджень, який включає різні методи аналізу, що значно підвищує надійність одержаних даних.

В зв’язку з цим нами вивчена можливість використання для виявлення лепонексу при хіміко-токсикологічних дослідженнях методів хроматографії в тонких шарах сорбенту (ТШХ), вискоефективной рідинной хроматографії ( ВЕРХ),  УФ- та ІЧ-спектроскопії.

Нами вивчені умови виявлення лепонексу за допомогою методу хроматографії в тонких шарах сорбенту. Вибір оптимальних систем розчинників різної полярності та тонких шарів проводили з урахуванням їх здатності розділяти лепонекс, співекстрактивні речовини з біологічного матеріалу, а також лікарські препарати, які можуть бути призначені разом з лепонексом (амітриптилин, аміназин та трифтазин).

В якості тонких шарів дляі ТШХ  використовували скляні пластини для високоефективної ТШХ “Merck” (Silica gel 60F₂₅₄ , Німеччина) та пластини “Sorbfil”, Росія (силікагель ПТСХ-II-А, тип основи ПЕТФ-Э).

При хроматографуванні вивчено чотирнадцять систем розчинників. Найбільш ефективні значення Rf  плям лепонексу спостерігаються в системах: хлороформ – діоксан – ацетон - 25% розчин аміаку (47,5:45:5:2,5); толуол-ацетон–етанол-25% розчин аміаку (45:45:7,5:2,5);  хлороформ – метанол (90:10);  метанол - 25% розчин аміаку (100:1,5 );  ацетон  –  вода  (1:1 ); етанол – 25% розчин аміаку ( 100:1,5); бутанол – ацетон – вода (4:5:1); етилацетат – ксилол –метанол-25% розчин аміаку ( 90:5:5:1,5 ).                          

Хроматографування проводили в камері об`ємом 1000 см³, в котру вносили по 50 мл систем розчинників. Камеру насичували протягом 30 хвилин. Перед використанням пластини обприскували 0,1 М розчином калію гідроксиду в метанолі, висушували й активували в сушильній шафі при 110 °С протягом 30 хв. Проби лепонексу, які вміщували від 0,2 мкг до 5 мкг речовини, та інших препаратів ( 0,05% розчини в метанолі)  наносили за допомогою скляного капіляру на лінію старту на відстані 2 см від краю пластини. Шлях перебігу розчинників - 8 см. Після досягнення системами розчинників лінії фронту пластини виймали з камери, висушували під тягою при кімнатній температурі і виявляли відповідними реактивами. В якості проявників були використані УФ-світло ( фіолетове забарвлення),  реактив Драгендорфа за Муньє ( червоно-коричневе забарвлення плям ), пари йоду ( коричневе забарвлення), послідовне обприскування 0,3М розчином міді сульфату та 0,3М розчином калію йодиду (коричневе забарвлення), реактив Ердмана (брудно зелене забарвлення), реактив Лібермана (буре забарвлення , яке швидко зникає),  реактив Форреста (оранжеве забарвлення, яке з'являється поступово), 3% розчин пероксиду водню при нагріванні (110ºC, протягом 10 хвилин) ( блідо рожеве забарвлення), розчин нінгідріну при нагріванні та  50% розчин кислоти сірчаної в етанолі не дають забарвлення плям лепонексу. Найбільш чутливими проявниками є реактив Драгендорфа за Муньє, пари йоду  та 0,3М розчин міді сульфату та 0,3М розчин калію йодиду (на пластинах «Sorbfil» і Merck вдається виявити 0,2 мкг і більше лепонексу).

Нами також вивчена можливість використання тонкошарової хроматографії для виявлення лепонексу в присутності інших лікарських препаратів, що можуть бути використані спільно з ним. Вибір оптимальних систем розчинників різноманітної полярності проводили з урахуванням їхньої здатності поділяти лепонекс, інші препарати, що можуть застосовуватися спільно з ним, та соекстрактивні речовини з біологічного матеріалу. Найбільшою поділяючою здатністю для препаратів, які можуть застосовуватися разом з лепонексом, володіють системи розчинників ацетон – вода ( 1:1 );  етилацетат – ксилол –метанол-25% розчин аміаку ( 90:5:5:1,5);  гексан –толуол –діетиламін (75:15:10);  циклогексан – толуол - діетиламін (75:15:10 ). Найбільш вибірковими проявниками плям досліджуваних препаратів є реактиви Ердмана та Форреста які дають з ними різні забарвлення. Cлід також відмітити, що плями лепонексу на відміну від плям інших препаратів, проявляються 3% розчином пероксиду водню після нагрівання (110ºC, протягом 10 хвилин).

Вивчена можливість застосування розроблених умов хроматографування для виявлення лепонексу та його очистки від співекстрактивних речовин в витяжках з біологічного матеріалу. Найбільш придатною для цієї мети виявилася система метанол - 25% розчин аміаку (100:1,5 ).

Вивчено УФ-спектри лепонексу в 0,1 М розчині кислоти хлороводневої (рис.1).

Максимуми абсорбції лепонексу спостерігали при 240 та 285-295 нм (плато), що відповідає даним літератури.

 Вивчена можливість застосування УФ-спектроскопії для ідентифікації лепонексу в витяжках з біологічного матеріалу. Встановлено, що співекстрактивні речовини заважають ідентифікації лепонексу цим методом. В зв’язку з цим необхідна додаткова екстракційна та хроматографічна очистка витяжок.

ІЧ-спектр лепонексу (в таблетках з KBr) характеризується наявністю смуг поглинання, см^–1: 1600, 1560,758,1136,1101,1117.

Окрім ТШХ у хіміко-токсикологічному аналізі для виявлення та розділення речовин дуже широко використовується метод ВЕРХ. У роботі вивчена можливість використання ВЕРХ для виявлення лепонексу, як індивідуальної речовини, так і при сумісній присутності з іншими антипсихотичними препаратами. Хроматографічний аналіз лепонексу здійснювали на мікроколонковому рідинному хроматографі “ Міліхром А-02”. Для досліджування використовували металічну обернено-фазну колонку розміром 2 x 75 мм, яка була наповнена сорбентом з прищепленою неполярною хімічно сполученою фазою – Nucleosil-100-5, C-18. Аналіз проводився у зворотньо-фазному варіанті.

 Як детектор застосовували двопроміневий мультихвильовий УФ-спектрофотометр (діапазон хвиль 190-360 нм, точність довжини хвилі 0,5 нм). Для хроматографічного дослідження застосовували буферний розчин з рН 2,18, концентрація якого становила 0,2 М відносно перхлорату літію та 0,01М відносно дигідрофосфату літію; органічний розчинник – ацетонітріл. Градієнтне подавання розчинника проводили від 20 до 100% ацетонітрілу зі швидкістю 100 кл/хв.

Для ідентифікації лепонексу використовували абсолютні (t_абс ) часи та абсолютні об'єми (V_абс)  утримування (9,18 хв та 918 мкл відповідно), а також спектральні відношення, одержані при їх детектуванні за сімома довжинами хвиль  УФ-спектра – 210, 220, 230, 240, 250, 260 і 300 нм. Нами були  також проведені дослідження з ідентифікації лепонексу в сумісній присутності з іншими нейролептиками, які можуть бути застосовані разом з ним (амітриптилін та аміназин) за умов зазначених вище. Спочатку було ідентифіковано кожну з речовин окремо. Хроматограма розділення суміші лепонексу зображена на рисунку 2.

Для оцінки хроматографічного розділення розраховували ступінь розділення піків (Rs);  селективність (α); коефіцієнт ємності (k').

Нами встановлено, що приготований розчин необхідно аналізувати  в день виготовлення, тому що препарат нестійкий, та швидко розкладається  під дією світла.

2. Кількісне визначення лепонексу

Для кількісного визначення лепонексу нами розроблені доступні і надійні екстракційно-фотометрична, УФ-спектрофотометрична методики, а також методика кількісного визначення лепонекску за допомогою ВЕРХ.

Екстракційно-фотометрична методика визначення лепонексу заснована на утворенні іонного асоціату препарату з метиловим оранжевим (молярне співвідношення 1:1), який при рН 4,6 екстрагується хлороформом. Вказаний іонний асоціат має малий питомий коефіцієнт світлопоглинання, тому для підвищення чутливості методу ми розкладали його за допомогою спиртового розчину кислоти сірчаної. При цьому виділялася еквівалентна препарату кількість вільного метилового оранжевого, що має значно більший питомий коефіцієнт світлопоглинання.

При розробці даного методу ми вивчили вплив рН водної фази на утворення та екстракцію іонних асоціатів лепонексу з метиловим оранжевим, вплив на цей процес кількості барвника, а також проводили вибір оптимального світлофільтра та робочої довжини кювети.

Оптичну густину забарвлених розчинів вимірювали на фотоколориметрі КФК-2 (світлофільтр з λ_еф = 540±10 нм, кювета з товщиною шару 10 мм). Оптична густина забарвлених розчинів підпорядковується основному закону світлопоглинання в межах концентрацій від 10 до 90 мкг лепонексу в пробі, що аналізується.

Розрахунок вмісту лепонексу в розчинах, що досліджували, проводили за допомогою градуювального графіку, або рівняння прямої, яке було розраховане за допомогою методу найменших квадратів: А = 0,009653∙С + 0,0937 , де А-оптична густина розчину , С-вміст лепонексу у пробі, в мкг.

 Відносна помилка визначень становить ±2,29 %. Метод застосований для кількісного визначення лепонексу в розчинах, а також в витяжках з біологічного матеріалу.

Для УФ-спектрофотометричного кількісного визначення лепонексу ми побудували спочатку градуювальний графік. Оптичну густину отриманих розчинів вимірювали на спектрофотометрі СФ-46, у кюветі з товщиною  шару рідини 10 мм, при довжині хвилі 240±2 нм. Як розчин порівняння використовували 0,1 М розчин кислоти хлористоводневої. Оптична густина розчинів лепонексу підпорядковується  основному закону світлопоглинання в інтервалах концентрацій від 12 мкг до 120 мкг лепонексу в 10 мл розчину. Для розрахунку вмісту лепонексу в розчинах користувались градуювальним графіком, або рівнянням прямої, яке було розраховане за допомогою методу найменших квадратів [1]: D = 0,008357С+0,00133 ,де D- оптична густина розчину , С- вміст лепонексу в 10 мл розчину, в мкг. Цей метод ми використовували для кількісного визначення лепонексу, виділеного з біологічного матеріалу (витяжка вимагає ретельного очищення від соекстрактивних речовин). Відносна помилка визначення середнього результату становить ±2,25%.

Кількісний аналіз лепонексу в модельних розчинах методом ВЕРХ проводили з урахуванням його максимуму поглинання  в УФ- області спектра (при λ 240 нм).

 Для визначення вмісту лепонексу в об'єктах досліджень використовували градуювальний графік, побудований в координатах – S лепонексу –С, мкг/мл      (площа піка лепонексу – концентрація лепонексу), для чого застосовували стандартний розчин лепонексу в метанолі ( вміст препарату – 50 мкг/мл). Лінійність побудованого графіка спостерігалась в інтервалі концентрацій 1,5-30мкг/мл. Чутливість методу становила 1,5мкг/мл препарату, що було визначено як кількість речовини у пробі, що відповідає сигналу, який у п'ять разів більший ніж рівень шумів у хроматографі. Відносна помилка складала ±2.27%.

3. Вивчення умов екстракції лепонексу з водних розчинів

Для наступної розробки оптимальних умов ізолювання лепонексу з біологічного матеріалу нами вивчено екстракцію препарату з водних розчинів деякими органічними розчинниками в залежності від рН середовища.

Використовували буферні розчини з рН від 2,0 до 11,0  ( рН 2,0 підтримували за допомогою розчину кислоти хлороводневої, рН від 3,0 до 5,0 за допомогою ацетатного буферного розчину, рН від 6,0 до 11,0 за допомогою 1М розчину гидроксиду натрія,). Кислотність буферних розчинів контролювали потенціометрично. Як органічні розчинники (екстрагенти) застосовували найбільш поширені в хіміко-токсикологічному аналізі, свіжоперегнані хлороформ, діетиловий ефір та гексан. Проводили одноразову екстракцію лепонексу. Об’єм органічного розчинника (екстрагента) дорівнював об’єму водної фази. 5 мл органічного шару випарювали на водяній бані в випарювальній чашці при температурі 30-40ºС, а потім до сухого залишку додавали 10 мл хлороформу або 10 мл 0,01М розчину кислоти хлороводневої, ретельно перемішували скляною паличкою. Визначали кількісний вміст лепонексу екстракційно-фотометричним методом. Залежність ступеню (R,%) екстракції лепонексу від рН середовища  приведені  на рисунку 3.

Одержані дані свідчать про те, що незначна кількість препарату екстрагується хлороформом та ефіром вже при рН 2,0-3,0. Хлороформ починає екстрагувати лепонекс із водних розчинів при рН 2-3 (ступінь екстракції 4,2-15,0%). Максимум екстракції препарату хлороформом має місце при рН 11 (ступінь екстракції біля 99%). Діетиловий ефір починає екстрагувати препарат також при рН 2-3 (ступінь екстракції 16,0-55,0%), а максимум екстракції в інтервалі, що досліджували, спостерігається при рН 11 (ступінь екстракції біля 99%). При використанні в якості органічного розчинника гексану, екстракція препарату починається при рН 5-6 (ступінь екстракції 3,3-16,2%), а максимум екстракції лепонексу гексаном спостерігається при рН 10,0 (ступінь екстракції складає біля 91%). Таким чином, для екстракції лепонексу з лужних водних витяжок краще використовувати хлороформ або діетиловий ефір. Для очищення витяжок з біологічного матеріалу від співекстрактивних речовин у кислому середовищі зручно застосовувати гексан або хлороформ , тому що при рН 2,0-3,0 хлороформ на відміну від діетилового ефіру екстрагує незначну кількість препарату.

4. Виділення лепонексу з біологічного матеріалу

В літературі відсутні відомості про методи виділення лепонексу з біологічного матеріалу.

Спочатку ми порівняли ефективність загальноприйнятих в хіміко-токсикологічному аналізі методів ізолювання органічних речовин основного характеру з біологічного матеріалу стосовно до лепонексу:

·        О.О. Васильєвої (витягання водою, підкисленою кислотою щавлевою);

·        В.П. Крамаренка (витягання водою, підкисленою кислотою сірчаною);

·        Стаса-Отто (витягання спиртом етиловим, підкисленим кислотою щавлевою).

Виявилося, що ці методи дозволяють ізолювати від 14% (Стаса-Отто) до 24%-28% (О.О. Васильєвої та В.П. Крамаренка) препарату з біологічного матеріалу (тканина печінки).

Ми поставили собі за мету розробити більш ефективну та експресну часну методику ізолювання лепонексу з біологічного матеріалу. Методика заснована на розтиранні подрібненого біологічного матеріалу, що містить препарат, з потрійною кількістю безводного натрію сульфату та наступним елююванням лепонексу з одержаної суміші у скляній колонці хлороформом. Хлороформний елюат піддавали додатковому екстракційному очищенню, оскільки наявність великої кількості співекстрактивних речовин заважала подальшому дослідженню витяжок.

Очищені проби витяжок використовували для ідентифікації лепонексу, виділеного з біологічного матеріалу за допомогою методу ТШХ, а також для кількісного визначення препарату  екстракційно-фотометричним та УФ-спектроскопічним  методами.

Розроблений метод ізолювання лепонексу за допомогою хлороформу дозволяє виділити 35-40 % препарату з біологічного матеріалу. Для виявлення лепонексу, виділеного з біологічного матеріалу методами УФ-, ІЧ-спектроскопії, необхідно додаткове очищення витяжок методами екстракції, ТШХ або іншими.

Слід зазначити, що співекстрактивні речовини з біологічного матеріалу часто заважають процесу хроматографування (розтягнуті плями лепонексу разом із співекстрактивними речовинами, близьке значення R_f препарату та вищезгаданих речовин). У зв'язку з цим пластини з нанесеними пробами попередньо двічі елюювали в камері з хлороформом до краю пластини. При цьому плями лепонексу залишалися на старті, а плями співекстрактивних речовин мігрували. Після цього пластини висушували та вміщували в камеру з системою розчинників метанол-25% розчин аміаку (100:1,5). В цих умовах спостерігався задовільний розподіл плям лепонексу та співекстрактивних речовин.

Для виявлення лепонексу методом УФ-спектроскопії попередню проводили екстракційну або хроматографічну очистку. Хроматографічну очистку проводили як зазначено вище. Після цього ретельно елюювали препарат з фрагменту шару сорбенту, який відповідав плямі лепонексу за допомогою метанолу. Екстракт відфільтровували та випарювали. Сухий залишок розчиняли в 0,1М розчині кислоти хлороводневої. При проведенні екстракційної очистки у випарювальну чашку поміщали хлороформну витяжку ( 1/10 частина хлороформної витяжки, що отримана одним із 4 методів ізолювання ), та випаровували її на водяній бані при t=30-40°C до сухого залишку , який розчиняли в 10 мл 0,1М розчину кислоти хлороводневої при ретельному перемішування скляною паличкою. Проводили ідентифікацію лепонексу в цьому розчині за допомогою методу УФ-спектроскопії.

Нами також запропоновані методики виділення лепонексу з біологічних рідин організму (крові, сечі).

Методика виділення лепонексу з крові заснована на осадженні формених елементів крові 0,1М розчином кислоти хлороводневої (з центрифугуванням), очищенні кислої водної витяжки хлороформом, підлуговуванні витяжки до рН 10 та екстракції препарату за допомогою хлороформу. Методика дозволяє виділити 64% лепонексу з крові.

Виділення лепонексу з сечі засноване на підкисленні проби з препаратом 0,1М розчином кислоти хлороводневої до рН 2,0-3,0, очищенні кислої водної витяжки хлороформом з подальшим підлуговуванням водної витяжки до рН 10 та екстракції препарату хлороформом. Методика дозволяє виділити 75-77% лепонексу з сечі.

Результати вивчення розподілу лепонексу в органах отруєних тварин (щурів) через 3 години після внутрішньошлункового введення препарату показали, що лепонекс в найбільших кількостях знаходиться в в шлунку зі вмістом, мозку, кишечнику зі вмістом, легенях, серці, нирках та печінці (в порядку зменшення). Тому саме ці органи варто відправляти на хіміко-токсикологічні дослідження  при летальних отруєннях лепонексом.

Вивчено зберігання лепонексу в трупному матеріалі при його гнитті. Вказано, що після 90-добового зберігання в біологічному матеріалі (тканина печінки) за допомогою методу ізолювання хлороформом можна виділити до 14% лепонексу.

ЗАГАЛЬНІ ВИСНОВКИ

1.   Запропоновано методи ТШХ, ВЕРХ, УФ-спектроскопії, що придатні для виявлення лепонексу, який виділено з біологічного матеріалу.

2.   Розроблено доступні і чутливі методики кількісного визначення
лепонексу:

а)  екстракційно-фотометрична, що заснована на утворенні іонного асоціату лепонексу з метиловим оранжевим; оптична густина забарвлених розчинів підпорядковується основному закону світлопоглинання в межах концентрацій від 10 до 90 мкг лепонексу в пробі. Відносна помилка визначень становить ±2,29 %.

б) УФ-спектрофотометрична, що дає можливість визначати від 12 мкг до 120 мкг лепонексу в 10 мл розчину. Відносна помилка визначення середнього результату складає ±2,25%.

в) методика кількісного визначення лепонексу за допомогою  ВЕРХ. Лінійність побудованого градуювального графіка спостерігається в інтервалі концентрацій 1,5-30мкг/мл. Чутливість методики становить 1,5мкг/мл препарату. Відносна помилка складає ±2.27 %

Методики застосовані для кількісного визначення лепонексу в хлороформних та водних розчинах  та в витяжках з біологічного матеріалу.

3.   Вивчено умови екстракції лепонексу з водних розчинів у залежності від рН середовища. Встановлено, що максимум екстракції препарату хлороформом має місце при рН 10. Для екстракційного очищення водних витяжок з біологічного матеріалу від співекстрактивних речовин у кислому середовищі зручно використовувати гексан та хлороформ.

4.   Вперше проведена порівняльна оцінка виділення лепонексу з біологічного матеріалу загальноприйнятими в хіміко-токсикологічному аналізі методами, а також розроблена більш ефективна і експресна часна методика ізолювання препарату за допомогою хлороформу. Методика дозволяє виділити 35-40% лепонексу з біологічного матеріалу.

5.   Вивчено умови виявлення лепонексу у витяжках з біологічного матеріалу методами ТШХ й УФ-спектроскопії. Для кількісного визначення препарату у витяжках з біологічного матеріалу застосовано екстракційно-фотометричний та УФ-спектрофотометричний методи.

6.   Запропоновано методики виділення лепонексу з біологічних рідин організму (крові і сечі), що дозволяють ізолювати до 64 і до 77% препарату відповідно.

7.   Встановлено, що найбільша кількість лепонексу, через 3 години після внутрішньошлункового введення тваринам, знаходиться в шлунку, мозку, кишечнику зі вмістом, легенях, нирках, серці та печінці. Ці органи рекомендовано відправляти на судово-хімічні дослідження біологічного матеріалу на лепонекс в разі летальних отруєнь препаратом.

8.   Вивчено зберігання лепонексу в біологічному матеріалі при його гнитті. Встановлено, що за допомогою методу ізолювання хлороформом через
90 діб з тканини печінки, що піддалася гнильним змінам, можна виділити до 14% препарату.

9.   На основі проведених досліджень запропоновано схему хіміко-токсикологічного аналізу біологічного матеріалу на лепонекс.