ПАСТЕРЕЛЬОЗ СВИНЕЙ. РОЗРОБКА НОВИХ ЗАСОБІВ ДІАГНОСТИКИ І СПЕЦИФІЧНОЇ ПРОФІЛАКТИКИ : Пастереллез СВИНЕЙ. РАЗРАБОТКА НОВЫХ СРЕДСТВ ДИАГНОСТИКИ И специфической профилактики

Краткое содержание

           Дослідження  проводили  в  період  з  1993  по  2003  рік у лабораторії  бактеріологічних  біологічних  препаратів  Київського  філіалу  Державного  науково-дослідного контрольного інституту ветпрепаратів, лабораторії  ветеринарно-санітарної експертизи Інституту ветеринарної медицини УААН, Житомирському  центрі  по  роботі  з  особливо  небезпечними  хворобами  тварин,  Сумській  біологічній  фабриці, лабораторії  інструментальних  методів  досліджень  Всеросійського державного науково-контрольного інституту ветпрепаратів (м. Москва), тваринницьких господарствах Чернігівської, Рівненської, Житомирської, Полтавської, Кіровоградської та Херсонської областей України.

           У дослідах було використано 6300  білих мишей, 130 кролів, 2038 поросят, 2 барани-донори еритроцитів.

           У виробничих умовах проведено бактеріологічні дослідження 1350 проб носових змивів, 200 проб біоматеріалу з легеневої тканини; досліджено властивості 1097 ізолятів пастерел, виділених від свиней в господарствах України, які були надіслані до ЦДЛВМ, ІВМ УААН та ДНКІБШМ протягом 1993-2001 рр., та 1462 ізоляти пастерел, які надходили до районних лабораторій під час спалахів пастерельозу свиней у господарствах ряду областей України; 254 штами пастерел, виділених від ВРХ; 46 штамів від ДРХ; 89 штамів пастерел від птиці; 37 штамів пастерел від кролів.

        Виділені і визначені як національні  стандарти  штами P.multocida, ліофільно висушені й закладені в ампулах для зберігання.

         Для роботи використані, крім того, штами S.сholeraе-suis та S.typhimurium, а також E.coli К88; E.coli К99 та E.coli Н7 _, які були виділені під час досліджень супутньої пастерелам мікрофлори (О.М.Панін,1993). При цьому враховували технологічний напрямок господарства, кількість виділених ізолятів, тип перебігу хвороби, наявність збудників інших інфекцій, вік та фізіологічний стан уражених тварин. Дослідження штамів  проводили за багатьма параметрами згідно з “Настановою з лабораторної діагностики пастерельозу тварин та птахів” і Міжнародним класифікатором бактерій Берджі (В.М Манченко,1995).

          Для визначення серотипової належності досліджуваних місцевих штамів застосовували 13 типоспецифічних референс-сироваток, отриманих з референс-центру (м. Пулави), та 9 вітчизняних кролячих типових сироваток. З досліджуваних штамів пастерел готували фракції соматичного та капсульного антигенів, користуючись методом швидкісного центрифугування та діалізу. 

         Виготовлення капсульної та соматичної субстанцій  з ізолятів розпочинали із  селекції типових колоній пастерел добової агарової культури. Відібрані колонії повторно культивували на МПА Хоттінгера добу. Для активації синтезу антигенного матеріалу клітинами пастерел до живильного середовища додавали 10% стерильної сироватки крові коня або амінопептид. Виготовлення антигенів розпочинали з вирощування добової агарової культури, яку змивали фізіологічним розчином (рН 7,0), і доводили до концентрації 20 млрд. мікр. клітин/см³. Далі частину виготовленої бактерійної суспензії прогрівали на водяній бані протягом 30 хвилин при температурі 56˚С при постійному шутелюванні. Стабілізований температурою завис бактерійних клітин центрифугували за частоти обертання 5000 об/хв протягом 40 хвилин у рефрижераторній центрифузі. Після цього надосадову рідину декантували як капсульний антиген (K.L. Mc Kinney, P.A. Refers,1982).

          Соматичний антиген готували з тієї ж бактерійної суспензії, що й капсульний. До певного об’єму завису (20 млрд. мікр. клітин / см³) додавали хімічно чисту трихлороцтову кислоту (ТХУ) в співвідношенні 1:1. Під час обробки ТХУ білки осідали, а кислоторозчинний поліцукровий комплекс соми екстрагували з аморфної маси бактерій у рефрижераторі при температурі 0˚С протягом 3-х годин. Після цього шляхом фільтрування відокремлювали від осаджених білків екстракт і здійснювали їх діаліз у целофанових мішечках у проточній водопровідній воді протягом 2-х діб і одну добу в дистильованій воді в рефрижераторі. В процесі діалізу виділялась ТХУ та інші речовини, що легко діалізують. Поліцукровий комплекс соми як колоїд не проникав крізь стінки целофанових мішечків. Закінченням діалізу вважали негативну якісну реакцію на ТХУ і нейтральне середовище діалізату. На вигляд діалізат, як правило, був ледь опалесцуючим. Для видалення власне антигену до діалізату додавали спирт етиловий в об’ємному співвідношенні 1:3-4. Антиген, що випав в осад, відокремлювали шляхом центрифугування.

        Стандартизували отримані антигенні субстанції, визначаючи в них вміст білка, за методом Лоурі в модифікації Міллера та амінного азоту за методом Зеренсена-Гаврилова (В.Н.Кікалішвілі,1963). Вміст вуглеводів у зразках антигенів визначали, враховуючи концентрацію гексоз у кольоровій реакції з ортотолуїдином (Н.П. Елінов,1984; А.Ф. Ленінджер,1985).

        Типову специфічність отриманих капсульних антигенів визначали в серологічних тестах за допомогою РДП та РНГА (Е.У. Пастер та ін.,1989).

        Токсичність антигенних субстанцій визначали за реакцією білих мишей на внутрішньоочеревинне їх введення у дозах від 1,3 до 5,0 мг, а імуногенну активність – в тесті протективного захисту з гострим зараженням білих мишей та кролів, яких попередньо щепили похідними цих субстанцій.

         Для виготовлення типоспецифічних кролячих гіперімунних сироваток користувались простою й зручною схемою гіперімунізації, яка передбачала грундімунізацію із застосуванням масляного ад'юванту Фрейнда та власне антигену – ПА культур P.multocida  серотипів А, В та Д.

         Субстанцію поверхневого (капсульної речовини) та соматичного антигенів використовували в наростаючих дозах 0,5; 1,0; 1,5; 2,0 та 2,5мг речовини з додаванням ад'юванту Фрейнда з інтервалом 4 доби.

        Активність отриманих сироваток, яка характеризувала специфічність та імуногенність капсульного і соматичного антигенів пастерел, оцінювали, застосовуючи РДП (Е.У.Пастер,1989), РНГА з антигенним еритроцитарним діагностикумом та ІФА з міченими пероксидазою Ig G кроля (концентрація за пероксидазою – 200 нг/см³) (Р.В.Петров,1990).

          Аналіз білкового та клітинного складу крові визначали за загальноприйнятою методикою (А.Я.Пустовар та ін.,1986; Н.В.Коротченко та ін.,1987). Виділяючи фракції лімфоцитів та досліджуючи процес їх трансформації у В- і Т-форми, користувались  методом розеткоутворення (В.А.Ткачов-Кузьмін, 1987; А.Я. Пустовар та ін.,1988).

         Дослідження епізоотології хвороби, клінічного прояву та патологоанатомічних змін у свиней при пастерельозі в господарствах України проводили загальноприйнятими методами (А.А.Колосов,1986;  В.П.Литвин,1995).

         Статистичне обчислення результатів досліджень здійснювали за допомогою обрахунків середньої арифметичної по групі (М) та середньої похибки середньої арифметичної (m). Коефіцієнт парної кореляції (r) розраховували для рядів взаємозалежних варіант. Вірогідність різниці показників (Р) визначали по таблиці Стьюдента, яким відповідали певні величини коефіцієнта вірогідності для групи варіант табличного значення числа ступенів свободи f (А.С.Винокуров,1982).

          Економічну ефективність розраховували згідно з викладками В.М. Константінова із співав. (1978) та Н.М.Нікітіна із співав. (1996). При математичному опрацюванні результатів досліджень використовували ЕОМ і застосовували комп'ютерні програми статистичної обробки Microsoft Excel.