ТЕОРЕТИЧНЕ ТА ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНЕ ОБГРУНТУВАННЯ КОНТРОЛЮ ГЕНОМУ КЛІТИН ПРИ ВІРУСНИХ ІНФЕКЦІЯХ ТВАРИН ТА В ПРОЦЕСІ РОЗРОБКИ ЗАСОБІВ ЇХ СПЕЦИФІЧНОЇ ПРОФІЛАКТИКИ : Теоретическое и экспериментальное обоснование КОНТРОЛЯ ГЕНОМА КЛЕТОК при вирусных инфекциях ЖИВОТНЫХ И В ПРОЦЕССЕ РАЗРАБОТКИ СРЕДСТВ ИХ специфической профилактики

Краткое содержание

  Дисертаційна робота виконана упродовж 1991-2006 років. Експериментальна частина роботи, апробація та виробнича перевірка результатів досліджень була проведена в Інституті ветеринарної медицини УААН: в лабораторії вірусології, лабораторії по розробці технології виготовлення інактивованої вакцини проти класичної чуми свиней, секторі по вивченню генетичної резистентності тварин, Державному науково-виробничому підприємстві “Біоветпрепарат”, тваринницьких господарствах Молдови, Вірменії, Північно-Осетинської Республіки та України (Одеської, Херсонської, Дніпропетровської, Луганської, Донецької, Львівської, Вінницької,  Івано-Франківської, Тернопольської, Черкаської, Київської  областей) .

Матеріалом для досліджень слугували проби органів і тканин хворих, інфікованих (РНК-вмісними вірусами) збудниками хвороб, забитих з діагностичною метою та контрольних тварин різних вікових груп свиней (тонкий відділ кишечника, печінка, нирки, легені, серце, селезінка, кров, фекалії, лімфовузли, мигдалики, кістковий мозок грудної кістки). Проби крові використовували для серологічних, імунологічних досліджень, отримання культур лімфоцитів. Визначення імуноглобулінів в крові свиней досліджували методом імунодифузії в гелі (Mancini G.J. et all., 1963; Тихомірова О.А., 1977). Вірусовиділення, культивування, атенуацію, титрування вірусів, реакції нейтралізації, дифузійної преципітації здійснено, застосовуючи загальноприйняті методи (Сюрін  В.М.,Фоміна Н.В., 1979; Лярські З., 1980). При культивуванні і титруванні вірусу класичної чуми свиней використовували метод прямої і непрямої імунофлуоресценції із застосуванням ФІТЦ-імуноглобулінів до вірусу КЧС у відображенному синьому світлі на люмінісцентних мі­кроскопах різних марок (МЛ-1, МЛ-3, МЛ-4, МЛД-1, ЛЮМАМ та інші) із збуджую­чими світлофільтрами ФС-1-2, СС-І5-2, БС-8-2, (СЕС-14) і замикаючим №1 або №2 (Ж-18, ЛС-1). Реакцію імунодифузії проводили згідно “Наставления по применению наборов для серологической диагностики лейкоза крупного рогатого скота» (затвердженого Департаментом ветеринарії Мінсільхозпроду РФ, 1997). Використанні первинно-трипсинизовані та перещеплювані культури клітин (КК) тестикулів, нирок, щитовидної залози (СН, СНЕВ, СНЕВ-М, ПСН, ПТП, КЩС, РК-15), лімфоцитів поросят, вирощених за “Методичними вказівками…” ІВМ (розробленими: Субаєвим Г.Х., 1981 та Жуковським А.М. із співробітниками, 1987).

Використані тварини : 479 кролів породи шиншила масою 2,5 – 3 кг, 80 кроленят 1-3- добового віку, 739 голів свиней (поросята-гнотобіоти, безмолозивні неімунні поросята, 3-5- місячні підсвинки, живою масою тіла в межах 35-70 кг, свиноматки), 20 голів  великої рогатої худоби чорно-рябої породи віком 2-2,5 роки живою масою тіла в межах 300-350 кг. Свиней інфікували вірусумісними рідинами (вільними від бактеріального забруднення) у відповідних дозах. При постановці біопроб на поросятах-гнотобіотах використовували стерильний корм та створювали особливі умови для попередження потрапляння сторонніх мікроорганізмів.  Дослідні і контрольні тварини, утримували в однакових умовах, виключаючи можливість контакту. При необхідності створювали додатково групу контактуючих тварин.Перевірку вірусів на патогенність і реверсибельність здійснювали на поросятах-гнотобіотах із щоденним клінічним оглядом і термометрією, відбором дослідного матеріалу.

Специфічні імунні сироватки до досліджуваних референтних, вакцинних і епізоотичних штамів РНК-вмісних вірусів свиней отримували від клінічно здорових кролів та підсвинків 3-5 -місячного віку. Для виявлення свіжих випадків захворювання тварин в господарствах використовували дослідження зразків парних сироваток крові (відібраних перший раз через 4-5 днів після прояву перших симптомів хвороби, другий- через 14 днів). Серологічні дослідження з виявлення підвищення титрів антитіл до збудників проводили паралельно з обома сироватками в однакових умовах в реакції нейтралізації.

Для роботи використані штами РНК - вмісних вірусів тварин: - ентеровірусів свиней (родини Pico aviridae, роду  Enterovirus) - референтні штами, які викликають синдром SMEDI, одержані з колекції патогенних мікроорганізмів тварин Ветеринарного науково-дослідного інституту м.Брно (Чехія), люб’язно передані для дослідження, з відповідними паспортами, провідним науковим співробітником лабораторії вірусології ІВМ, к.м.н. В.Н. Тацькою: - штам “PS 34” / CAPM v-305/, серотип 1(SMEDI C);- штам “02 b“/ CAPM v-248/,серотип 3 (SMEDI B);- штам “PS 37” / CAPM v-251/,серотип 6 (SMEDI E);- штам “PS 27” / CAPM v-252/, серотип 8 (SMEDI A ). Ці штами були адаптовані до перещеплюваних культур клітин СН , СНЕВ, ПСН (до 31 пасажу)  з титром інфекційності 5,5 -7,5 lg ТЦД ₅₀ / см³ , (штами із відповідними паспортами);

- коронавірусу свиней (родини Coronaviridae, роду Coronavirus): - референтний штам вірусу ТГС (ВТГС) “Пурдью-115”, 45 пасаж в перещеплюваній культурі клітин СНЕВ з титром інфекційної активності 5,75 ± 0,1 lg ТЦД₅₀/см³, який зберігали при - 20 ± 2 º С; - вакцинний штам “M-42”, отриманий  із референтного центру Ветеринарного інституту м.Брно (Чехія); - штам “П 1439 /81”, 65-й пасаж в культурі клітин ПТП з титром інфекційної активності 3,5 ± 0,21 lg ТЦД₅₀/см³  та 80 –й пасаж в культурі клітин СНЕВ, які зберігали при – 20 ± 2 º С ( з відповідними паспортами);

- ротавірусу свиней (родини  Reoviridae, роду Rotavirus) : - штам ”К” ротавірусної хвороби синей, одержаний із лабораторії хвороб свиней Всесоюзного Інституту експериментальної ветеринарії (ВІЕВ), Москва, Росія в 1990 році, з відповідним паспортом, з титром інфекційності в моношарових перещеплюваних культурах клітин нирок та тестикул поросяти (СНЕВ, ПТП) 6,0-7,5 lg ТЦД50 /см³, (штам з відповідним паспортом);

- пестівірусу класичної чуми свиней  (родини  Flaviviridae,  роду Pestivirus): - вакцинні штами “ЛК-ВНДІВВІМ”, лапінізований штам “К”, “Малазія”, вірулентний - ”Ши-Минь”,  передані для досліджень завідуючим лабораторією по розробці технології виготовлення інактивованої вакцини проти класичної чуми свиней ІВМ, д.в.н. В.А. Прискокою. Зразки лапінізованого штаму “К” вірусу КЧС отримували і із Сумської біологічної фабрики з титром інфекційності 10⁴ ІД_50/ см³ , “ЛК-ВНДІВВіМ” - із ліофілізованої вакцини Покровського заводу біопрепаратів серій № 15 та  № 95).

При встановленні структури популяції ротавірусу свиней за S-ознакою досліджено і проаналізовано 6711 негативних колоній ротавірусу під агаровим покриттям (за методом Ysiung G.D. i Melnick J.L., 1957). Стійкість вірусів до дії жиророзчинників визначали обробкою вірусумісних рідин 5 %-вим розчином хороформу.

Дослідження морфологічної структури вірусів тварин, їх морфогенезу в інфікованих клітинах, виявлення вірусів в пробах патологічного матеріалу від тварин та виділених з культур клітин проводили, застосовуючи методи електронномікроскопічних досліджень: прямої електронної мікроскопії, негативного контрастування із використанням 2-4 % -го розчину фосфорно-вольфрамової кислоти, 2-4 %-го розчину молібденовокислого амонію, 0,5 - 1 %-го розчину уранілацетету.

При вирощуванні біомаси калусної культури кореня женьшеню за основу брали виготовлення поживного середовища (Т. Murashige, F. Skoog, 1962) з використанням наступних етапів: приготування маточних розчинів солей  № 1 та № 2, хелату заліза, альфа-нафтилоцтової кислоти, тіамінхлориду, кінетину; приготування наважок мезоінозиту, гідролізату казеїну, сахарози; приготування агарового гелю; формування остаточного варіанту поживного середовища.

Вивчення спадкового апарату клітин свиней проводили із застосуванням цитогенетичних методів досліджень метафазних пластинок хромосом клітин тварин (по 200 на одне дослідження) за методами (Moorhead P.S. et all., 1960; Дарлінгтон С.Д., Кур Л.Ф.,1980; Яковлев О.Ф., 1981; Макгрегор Г., Варлі Д., 1986). Всього проаналізовано 7150 метафазних пластинок хромосом соматичних клітин свиней.  Полімеразну ланцюгову реакцію виконували згідно прийнятих методів (K.Mullis, F.Faloona F., 1987; L.A.Donehower, 1990; A.Limansky, O.Limanskaya, 2002). Використані водні екстракти рослин: Rosmarinum officinalis L., (Lamiaceae), Angelica silvestris L. (Apiaceae), Brassica oleracea: Broccoli (Brassicaceae), Hyppophae rhamnoides (Elaeagnaceae), Panax radix ( Araliaceae), приготовані за відомими прописами фармакологічних довідників.

Бактерицидну і лізоцимну активності сироватки крові визначали за методами, описаними О.О. Смірновою, Т.А. Кузьміною, 1966; В.Е. Чумаченко та ін., 1990. Статистична обробка результатів – за методом Стьюдента, Д.У.Стедекора, 1961; Г.Ф.Лакіна, 1980.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ АНАЛІЗ

Виділення та індикація РНК-вмісних вірусів тварин-збудників інфекційних хвороб

В результаті комплексу досліджень із застосуванням біопроб на поросятах-гнотобіотах та безмолозивних одноденних поросятах, електронної мікроскопії, серологічної діагностики виявлено наявність збудників: рота- та коронавірусів свиней в пробах матеріалів від інфікованих, хворих і загиблих свиней при спалахах вірусних гастроентеритів в господарствах України, Вірменії, Молдови. Виділені віруси представлені: на рис.1 - польовий ізолят ротавірусу свиней, виділений з фекалій хворих тварин радгоспу “Заря” Любашівського району Одеської області; на рис.2 – коронавірусні часточки, виділені від поросят-гнотобіотів з біопроби; на рис.3 - польовий ізолят вірусу ТГС, виділений від поросят Советошинської свинофабрики (Вірменія). Встановлено, що взаємодія вірусів і чутливих клітин відбувалась постадійно. Кожна стадія мала характерні ознаки, які спостерігали при інфікуванні клітин досліджуваними патогенами (ротавірусом, ентеровірусами, коронавірусом свиней).

Переважна більшість дослідників вважають, що початковою стадією взаємодії рота- та коронавірусів свиней з ентероцитом кишечнику поросят (клітиною-мішенню) є адсорбція вірусної часточки на мембрані клітини. За нашими даними, розвиток ранньої взаємодії цих вірусів з ентероцитом дещо інший: його мікроворсинки пошкоджувались ще до адсорбції цих вірусів на специфічних рецепторах клітини (рис. 5 та рис.6). Для порівняння представлено частину інтактного ентероциту кишечнику контрольного поросяти з неушкодженою мікроворсинковою каймою (рис. 4). Але, розвиток інфекційного процесу залежить від взаємодії всієї популяції патогену та популяцій чутливих біологічних об´єктів.

Виявлення змін в популяції ротавірусу свиней в процесі адаптування до культури клітин за S-ознакою. Пристосування вірусів до чутливих хазяїв відбувалось завдяки тривалій еволюції цих об´єктів. Розвиток епізоотичного

процесу залежить від взаємодії патогенів і чутливих організмів, а саме- їх популяцій. Виявлення закономірностей існування популяцій збудників слугуватиме новим підходам у створенні профілактично-лікувальних засобів. Оскільки нами встановлені однакові стадії морфогенезу ротавірусу свиней в інфікованій клітині різних чутливих об´єктів (культур клітин і тварин), тому, як модель взаємодії вірусу і сприйнятливого хазяїна ми обрали ротавірус свиней та перещеплювану культуру клітин ПТП свинячого походження, до якої вірус адаптований тривалим пасажуванням. Досліджена взаємодія патогену і чутливих клітин протягом їх тривалого контакту на рівні популяцій і змін їх поколінь (що відбувається і при перебігу епізоотичного процесу). Встановлені зміни, що виникають у структурі популяції (за S-ознакою) збудника ротавірусної хвороби свиней штаму ”К”. На рис.9  представлений її вигляд під

агаровим покриттям (за S-ознакою). Результати наведені в табл. 1. Паралельно з дослідженням змін в структурі популяції ротавірусу визначали його інфекційну активність, а також вплив на спадковий апарат клітин in vitro. Аналіз наведених в табл. 1. результатів виявив, що склад вірусної популяції (за S-ознакою) протягом 85 пасажів у культурі клітин ПТП змінювався (діаметр бляшок, утворених вірусом був від £1,0 мм до 5,0 мм). Кількість утворюваних вірусом бляшок певного розміру у межах груп коливалась від пасажу до пасажу. Однак, основна категорія - це дрібні бляшки, з діаметром £ 1,0 мм та ≤ 1,0–1,49 мм. Слід відмітити, що в популяції вірусу виявили незмінну складову, так зване “ядро”, яке складалось з бляшкоутворюючих одиниць (БУО), постійно присутніх у 85 пасажах, що викликали бляшки  діаметром £ 1 мм, інші категорії - змінювались від пасажу до пасажу. До того ж, у вірусній популяції з’являлись з різних причин БУО,  які не постійно присутні в популяції збудника.

Таким чином, встановили, що популяція ротавірусу свиней гетерогенна, мінлива за S‑ознакою.  Присутність стабільної мікропопуляції не впливала на зміну інфекційної активності вірусу і не залежала від неї. Існування стабільної складової у вірусній популяції важливо враховувати при епізоотологічних дослідженнях, а також при розробці профілактичних препаратів та  вивченні еволюції вірусів.

Виявлення мутагенної дії РНК-вмісних вірусів тварин

Виявлення мутагенної дії рота­вірусу, збудника ротавірусної хвороби свиней. Паралельно із моніторинговими дослідженнями розповсюдження збудника ротавірусної хвороби свиней, виявлення етіологічної структури і патогенезу хвороби, тестуванні створенних вакцин, а також проведення профілактичних заходів, нами досліджено вплив як епізоотичних (вірулентних) штамів ротавірусу свиней, так і вакцинного культурального штаму „К” ротавірусу на хромосоми клітин свиней (таблиця 2). Дослідженнями, проведеними у біопробі на поросятах-гнотобіотах, встановлено, що у контрольних тварин рівень клітин з абераціями хромосом був 6,75 ± 0,2 %, у інфіковних польовим ізолятом ротавірусу - 39,08 ± 0,3 %. Серед ушкоджень значну частку становили розриви хромосом (19,2 %) і хроматид (15,4 %). При дослідженні метафазних пластинок хромосом лімфоцитів хворих поросят-віднятих з господарства, де ротавірусна хвороба перебігала як моноінфекція, найбільшу частину пошкоджень становили подвійні та поодинок