ОТРИМАННЯ ТРАНСФЕР-ФАКТОРУ АНТИРАБІЧНОГО ТА ЙОГО ІМУНОБІОЛОГІЧНІ ВЛАСТИВОСТІ : ПОЛУЧЕНИЕ ТРАНСФЕР-ФАКТОРА антирабического И ЕГО иммунобиологического свойства

Краткое содержание

      Роботу виконано на базі кафедри мікробіології, вірусології та біотехнології Національного аграрного університету. Окремі дослідження проведено у лабораторіях Інституту інфекційних хвороб МОЗ України, лабораторіях імунології та біохімії НДІ екогігієни і токсикології ім. Л.С. Медведя МОЗ України, навчально-дослідних господарствах НАУ («Великоснітинське» та Агрономічна дослідна станція), розташованих відповідно у Фастівському та Васильківському районах Київської області.

      Як тварин-донорів трансфер-фактору антирабічного використали свиней породи велика біла,  масою тіла 80 – 90 кг, віком 7 – 8 міс., а як тварин-реципієнтів – білих нелінійних мишей масою 18 – 20 г та нелінійних морських свинок масою 250 – 300 г. Всього використано 20 голів свиней, 100 морських свинок та 300 білих мишей.

      Для імунізації свиней з метою отримання трансфер-фактору та вивчення реакцій клітинного та гуморального імунітету при введенні антирабічної вакцини застосовували інактивовану концентровану антирабічну культуральну вакцину КоКАВ, виготовлену із культури виробничого штаму вірусу сказу «Внуково-32», виробництва НДІ поліомієліту та вірусних енцефалітів РАМН. Як антиген при вивченні протективних властивостей трансфер-фактору антирабічного використовували вірулентний штам вірусу сказу CVS. При вивченні ад’ювантних властивостей препарату трансфер-фактору за  антирабічної імунізації лабораторних тварин застосовували вакцину антирабічну інактивовану суху культуральну із штаму «Щолково 51-К» серія № 2 (Херсонська державна біофабрика). Як алерген для постановки реакції гіперчутливості сповільненого типу було взято вакцину КоКАВ та інактивований вірус сказу штаму CVS.

      При проведенні досліджень за принципом аналогів сформували три групи свиней, по 6 голів у кожній. Тварин першої групи імунізували одноразовим введенням вакцини. Свиням другої групи вакцину вводили триразово - на першу, сьому та 21-у добу, а третьої групи (контроль) замість вакцини вводили стерильний апірогенний 0,85% розчин NaCl. Препарат вводили внутрішньом’язово в дозі 1,5 см³ у привушній ділянці каудального косого м’яза голови. У тварин відбирали кров до ін’єкції, через 6 діб після першого та через 6 діб після третього введення вакцини з метою визначення антирабічних антитіл.

 Забій тварин першої групи і відбір матеріалу для виготовлення діалізного екстракту лімфоцитів проводили на 7 добу після одноразового введення вакцини, другої – на 7 добу після третьої вакцинації, третьої – одночасно з тваринами другої групи. Забивали по 3 свині з кожної групи.

     Визначення концентрації антитіл у сироватці крові піддослідних тварин, специфічних щодо вірусу сказу, проводили за допомогою твердофазного імуноферментного аналізу із застосуванням тест-системи діагностичної  імуноферментної «ІФА RABIES AB», виготовленої в лабораторії  ветеринарної мікробіології, вірусології та імунобіотехнології НАУ (ТУУ 24.4).

     Стан гіперчутливості сповільненого типу у тварин-донорів визначали за допомогою алергійної проби при внутрішньошкірному введенні 0,01 імунізуючої дози рабічного антигену та in vitro – в реакції інгібіції міграції лейкоцитів (РІМЛ) у пластикових чашках Петрі під шаром агарози за методикою Г.Фрімеля (1987). Постановку шкірної проби та відбір крові для РІМЛ проводили через 6 діб після одноразового та триразового введення вакцини.

     У вакцинованих свиней визначали такі показники імунітету : вміст лімфоцитів та їх субпопуляцій (Т-теофілінрезистентних та Т-теофілінчутливих, В- і 0-клітин) – за розеткоутворенням з еритроцитами барана за методикою И.А. Бакулова (1998) та Г.Фрімеля (1987), загального білку – за методом біуретової реакції, а його фракцій у сироватці крові – методом електрофорезу на папері (Колб В.Г., Камышников В.С., 1982). Концентрацію циркулюючих імунних комплексів (ЦІК) визначали в динаміці: до вакцинації, на першу, другу, третю, сьому та 21-у добу після вакцинації методом ПЕГ-преципітації (Digeon M., Bach J., 1977). Розмір імунних комплексів визначали згідно скринінг-тесту за оцінкою патогенних властивостей ЦІК (Стручков П.В. и др., 1985). Трансфер-фактор отримували з діалізованих екстрактів лімфоцитів органів лімфоїдної системи свиней, у яких відзначався стан виразної сенсибілізації. Клітини руйнували шляхом десятикратного заморожування – відтанення при температурах відповідно – 40⁰ С та + 37⁰ С у присутності панкреатичної ДНКази-1 і MgSO₄. Ряд зразків препарату піддавали обробці ультразвуком при частоті 22 кГц протягом 10 секунд двократно (Lawrence H.S. et al., 1974). Після осадження клітинного детриту екстракт діалізували при 4⁰ С протягом 24 годин проти стерильної апірогенної дистильованої води. Досліджували наступні зразки ДЕЛ – ТФС-1 (виділений із селезінок одноразово вакцинованих свиней), ТФл/в-1 (виділений із лімфатичних вузлів триразово вакцинованих свиней), ТФС-3 та ТФл/в-3 (виділені із відповідних лімфоїдних органів триразово вакцинованих свиней) і Рабіфарм – комбінований ДЕЛ селезінок та лімфатичних вузлів одноразово вакцинованих свиней. Кожний зразок діалізату перевіряли на стерильність шляхом посіву на м’ясо-пептонний агар (МПА). Препарати зберігали у морозильній камері при  –18º С. 

      Амінокислотний склад препарату визначали методом іоннообмінної хроматографії на автоматичному амінокислотному аналізаторі ААА – 339 М, виробництва « Мікротехнс » (Прага) за методикою D.H. Spackman et al. (1968).

      Для перенесення гіперчутливості сповільненого типу (ГСТ) з викорстанням отриманих зразків трансфер-фактору реципієнтами слугували нелінійні морські свинки та білі миші. Одна доза ТФ відповідала діалізату 4 х 10⁸ клітин. ТФ морським свинкам вводили підшкірно. Через шість діб після сенсибілізації кожній свинці внутрішньошкірно на внутрішній поверхні стегна вводили по 0,05 мл антирабічної вакцини КоКАВ в розведенні 1 : 10. Білим мишам зразки антигеноспецифічного та неспецифічного трансфер-фактору вводили внутрішньочеревно в тій же дозі. Через шість діб в плюсневий м’якуш правої лапи вводили по 0,05 мл антирабічної вакцини КоКАВ у розведенні 1 : 10, а у м’якуш лівої – стерильний апірогенний 0,85 % розчин NaCl в тому ж об’ємі. Товщину шкірної складки вимірювали перед введенням алергену та через 24, 48, 72, 96 годин після введення до повного зникнення набряку та еритеми. Результати перенесення стану ГСТ ксеногенним реципієнтам визначали за допомогою реакції інгібіції міграції лейкоцитів, оброблених досліджуваними зразками ТФ, у пластикових чашках Петрі під шаром агарози за методом Г.Фрімель (1987). Для сенсибілізації лейкоцитів селезінок інтактних мишей застосовували зразки трансфер-фактору антирабічного, отримані із лімфоїдних органів одноразово (ТФС-1, ТФл/в-1) та триразово (ТФС-3, ТФл/в-3) вакцинованих свиней.

      Здатність Т-лімфоцитів до формування Е-розеток під впливом ТФ вивчали у реакції розеткоутворення з еритроцитами барана та відновлення розеткоутворення у трипсинізованих клітин за методикою И.А. Бакулова (1998).

      Інтенсивність бластоутворення тест-лімфоцитів периферійної крові морських свинок, сенсибілізованих ТФ та антирабічною вакциною КоКАВ, досліджували за допомогою реакції бластоутворення лімфоцитів у присутності специфічного антигену та фітогемаглютиніну, рекомендованою Arala-Chaves M.P. et al. (1987).

      Визначення впливу тестованих зразків ТФ на фагоцитарну активність нейтрофілів морських свинок та перитонеальних макрофагів мишей проводили мікроскопічним методом (Бакулов И.А., 1998). Як об’єкт фагоцитозу використовували суспензію дріжджів. Вираховували активність та індекс фагоцитозу.

     Вплив ТФ антирабічного і рекомбінантних α- та γ-інтерферонів (Комбіферон) на оксидативну активність поліморфонуклеарних лейкоцитів (ПМНЛ) кролів вивчали за продукцією пероксиду водню і окисленні ним фенолового червоного (Pick E., Keisari Y., 1980). Ад’ювантні властивості ТФ досліджували на морських свинках, при введенні тестованих зразків ТФ за добу, одночасно та на наступну

добу після імунізації тварин антирабічною вакциною КАВ. Вакцину вводили триразово : на першу, сьому та 28-у добу. Кров відбирали за дві доби перед початком досліду і через п’ять діб після другої та третьої вакцинації, в якій досліджували гематологічні та імунологічні показники: загальну кількість лімфоцитів, Т- теофілінрезистентних і Т-теофілінчутливих, інтенсивність бластоутворення під впливом ФГА і специфічного антигену ( Бакулов И.А., 1998). 

      Протективні властивості зразків ТФ визначали на 14 групах нелінійних білих мишей по 6 тварин в кожній. Досліджувані зразки ТФ вводили за різними схемами до, одночасно та після зараження. Зараження тварин проводили вірулентним штамом вірусу сказу (CVS), який вводили внутрішньом’язово в дозі 200 мкл (100 LD₅₀), який готували із 20% мозкової суспензії мишей, заражених інтрацеребрально, при розведенні 1:100