МІКОБІОТА ЗЕРНА ЯЧМЕНЮ, БІОСИНТЕЗ І БІОЛОГІЧНА ДІЯ ОХРАТОКСИНУ А

Краткое содержание

Дисертаційна робота виконувалась протягом 2003–2006 рр. у науково-дослідній лабораторії кафедри мікробіології та вірусології Білоцерківського державного аграрного університету. Під час проведення видової ідентифікації деяких грибів консультативну допомогу отримували у відділі фізіології і систематики мікроміцетів Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України у кандидата біологічних наук О.В. Соколової. Підтвердження кількісного визначення вмісту охратоксину А у субстратах з метою постановки експериментального охратоксикозу перепела японського виконувались у відділі хіміко-токсикології і радіології Київської міської державної лабораторії ветеринарної медицини, який акредитований у системі ISO 17025 DAP.

Об’єктом досліджень були 100 зразків зерна ячменю урожаю 2003 та 2004 рр., відібрані у трьох фізико-географічних регіонах країни в період зберігання. У зоні Полісся зерно відбирали у Чернігівській та Сумській областях, у лісостеповій зоні – у Київській, Вінницькій і Черкаській областях та у степовій зоні – у Запорізькій області і АР Крим. Проведено також дослідження 2-х зразків зерна з Донецької та Черкаської областей, згодовування якого сільськогосподарським тваринам викликало захворювання на мікотоксикози.

Зразки для досліджень відбирались у сільськогосподарських та зернопереробних підприємствах, а також у обласних і районних насіннєвих інспекціях. Відбір зерна для мікологічного дослідження проводили, керуючись методичними вказівками із санітарно-мікологічної оцінки і поліпшення якості кормів відповідно до ГОСТ 13586, 3-83 та ДСТУ 3570–97.

Епіфітну мікофлору виявляли методом прямої інокуляції, для чого по 10 зерен розміщали по поверхні середовища Чапека у чашках Петрі. Для виділення ендофітної мікобіоти зерно перед посівом обробляли 3%-ним розчином формаліну протягом трьох хвилин, а потім промивали стерильною водою, до якої додавали  5%-ний розчин аміаку. Посіви культивували в термостатах при 24 та
37 °С протягом 7-ми діб.

Для встановлення ступеня контамінації матеріалу мікроміцетами (кількість колонієутворювальних одиниць в 1 г зерна) застосовували метод серійних розведень. Для цього наважку подрібненого зерна масою 10 г заливали стерильною водою до 100 мл та струшували протягом 20 хвилин. Після цього готували послідовні розведення 1:100, 1:1000 та 1:10000, вносили по 1 мл на поверхню середовища Чапека, висіваючи суспензії з розрахунку одне розведення на дві чашки Петрі. Інкубацію проводили при 24 та 37 °С, і колонії підраховували на
3–5-й дні після посіву. Вміст колонієутворювальних одиниць у 1г зерна вираховували за формулами [5].

З метою отримання чистих культур гриби родів Aspergillus і Penicillium висівали на скошене середовище Чапека, а Fusarium spp. – на сусло-агар. Ідентифікацію виділених штамів до видів і різновидів проводили з використанням загальноприйнятих визначників. У разі ізоляції штамів фузаріїв, які не утворювали конідій, для їх ідентифікації використовували метод мікрокультури (Билай В.И., Элланская И.А., 1975). Розміри конідій, міцелію та інших елементів грибів встановлювали мікроскопією роздавленої краплі з використанням окуляр-мікрометра.

Визначення токсичності 67 ізолятів Fusarium spp. проводили з застосуванням мікробіологічного методу, суть якого полягає у пригніченні росту чутливого до трихотеценових мікотоксинів тест-мікроорганізму Candida pseudotro-picalis шт.
44 ПК (Рухляда В.В., Башмакова Е.В., 1988). При цьому для встановлення токсичності колоній фузаріїв, що виросли в первинних посівах зерна або були вирощені у чистих культурах в чашках Петрі, використовували метод агарових блоків.

22 штами фузаріїв досліджували на здатність продукувати Т-2, F-2 токсини, ДОН та моніліформін, для чого їх культивували на 10 г стерильного, зволоженого зерна ячменю у колбах об’ємом 100 мл. Кількісний вміст Т-2 токсину в екстрактах з культур грибів визначали модифікованим методом тонкошарової хроматографії з біоавтографією (Рухляда В.В., 1998).

З метою визначення наявності дезоксиніваленолу в екстрактах з культур грибів застосовували метод тонкошарової хроматографії (ТШХ), для чого на стартову лінію пластини для хроматографії Sorbfil за допомогою мікрошприца наносили екстракти і паралельно – стандартний розчин ДОНу. Після розподілу в системі розчинників гексан–ацетон (3:2) пластини просушували, обробляли 10 %-ним розчином алюмінію хлориду в етанолі, прогрівали в сушильній шафі протягом  5 хв при 105 °С, після чого ДОН виявлявся в УФ-промінні у вигляді плям із синьою флуоресценцією з Rf 0,35–0,40 (Жбураєв В.І., 1990).

Для детекції моніліформіну екстракти наносили на пластини Sorbfil і хроматографували в системі толуол – ацетон – метанол (5:3:2), токсин проявлявся в УФ-світлі з довжиною хвилі 254 нм у вигляді плям поглинання з Rf 0,27. Наявність моніліформіну підтверджували обробкою хроматограм розчином 2,4-ди-нітрофенілгідразину в соляній кислоті з наступним прогріванням їх протягом     10 хв при температурі 110 °С. Після цього токсин проявлявся у видимому світлі плямами червоно-коричневого кольору (Rabie L. et al, 1978).

Зеараленон на хроматограмах виявляли в УФ-променях з довжиною хвилі 365 нм. На хроматограмі з’ясовували наявність речовини з Rf  і характером світіння, аналогічним стандарту зеараленону, який проявлявся в ультрафіолеті у вигляді плями з блакитною флуоресценцією і Rf 0,64 ±0,05. Присутність токсину підтверджували шляхом обробки хроматограм 20%-ним розчином сірчаної кислоти в метанолі з наступним прогріванням у сушильній шафі протягом 5 хв при температурі 120 °С, після чого токсин проявлявся у вигляді плям жовто-цегляного кольору (Ображей А.Ф. та ін., 1998).

У процесі розробки експресного способу визначення здатності грибів роду Fusarium продукувати зеараленон використовували 6 штамів фузаріїв різної активності (F.culmorum, F.graminearum, F.sporotrichiella var. poae), здатність яких продукувати зеараленон була встановлена раніше традиційним методом.

Фузарії культивували на сусло-агарі, сусло-агарі із глутаміновою кислотою (10 г/л), середовищі Чапека, середовищі Чапека із глутаміновою кислотою (10 г/л), середовищі Чапека із пептоном (10 г/л), середовищі Чапека із дріжджовим екстрактом (5 г/л), середовищі Чапека із пептоном (10 г/л) і дріжджовим екстрактом (5 г/л) та середовищі, до складу якого входили 100 мл води, 2 г желатину, 0,8 г глутамінової кислоти, 2 г крохмалю, 1 г глюкози, 0,2 г нітрату натрію,
0,1 г однозаміщеного калію фосфату, 0,05 г магнію сульфату, 0,05 г калію хлориду,   0,001 г заліза сульфату. Фузарії культивували в 50 мл пробірках на 15 мл скошеного середовища.

Для встановлення оптимального терміну культивування фузарії вирощували при трьох варіантах температурних режимів: перший – 12 діб при t° 24 °С та
3 доби при 4 °С, другий – 8 діб при t° 24 °С та 4 доби при t° 4 °С і 7 діб – 24 °С та третій – 3 доби при t° 4 °С і токсин виявляли методом ТШХ.

Здатність продукувати охратоксин А, коєву, пеніцилову, аспергілову кислоти і афлатоксин встановлювали у 15 ізолятів роду Aspergillus. Охратоксинутворювальні властивості досліджували у штамів A. niger та A. ochraceus, для чого їх культивували на зернових субстратах, а токсин виявляли методом ТШХ та високоефективної рідинної хроматографії (ВЕРХ). Для вивчення здатності продукувати коєву, пеніцилову і аспергілову кислоти та афлатоксин, гриби культивували на цукрово-дріжджовому середовищі, і наявність токсинів встановлювали методом ТШХ (Львова Л.С. и др., 1978). Аспергілову кислоту виявляли в культуральній рідині, яка під час взаємодії зі спиртовим розчином хлориду феруму забарвлювалась у червоний колір, а з мідним купоросом – в зелений. Стандарти Т-2 і F-2 токсинів були надані науковим керівником, професором В.В. Рухлядою, ДОНу – доктором ветеринарних наук А.М. Котиком. Охратоксин А застосовували російського виробництва (ГСО 7941-2001), а решта мікотоксинів були люб’язно надані Київською міською державною лабораторією ветеринарної медицини.

З метою підтвердження здатності штамів A. niger продукувати ОТА встановлювали характер дії їх екстрактів шляхом внутрішньочеревного введення трьом білим мишам у дозі 0,3 мл з подальшим проведенням гістологічних досліджень печінки та нирок загиблих тварин, порівнюючи з описаними змінами у мишей при експериментальному охратоксикозі А.

З метою вивчення впливу охратоксину на організм перепела японського та дослідження антитоксичних властивостей L-фенілаланіну, в дослідах використали 24 п’ятитижневих перепелів масою 180 г, з яких було сформовано три групи-аналоги по 8 голів у кожній. Птахи першої групи отримували ОТА внутрішньо в дозі 5 мг/кг протягом 14 діб, другої – L-фенілаланін у кількості 550 мг/кг та ОТА, а третя група була контрольною. Охратоксин вводили внутрішньо у 1,4%-ному розчині натрію гідрокарбонату, а L-фенілаланін – у вигляді водного розчину. Перепелів зважували на початку досліду та на 7-й і 14-й дні, в ці ж дні відбирали кров методом декапітації (по чотири птиці кожного разу). У сироватці крові визначали рівень сечовини за діацетилмонооксимним методом, активність загальної лактатдегідрогенази (ЛДГ_заг) і кардіоспецифічного ізоферменту – ЛДГ₁ встановлювали методом Севела-Товарека, а аспартат-(АСТ) і аланінамінотрансфераз (АЛТ) – уніфікованим динітрофенілгідразиновим методом Райтмана–Френкеля. Окрім того, гістологічно досліджували печінку, нирки і серце.

Біохімічне дослідження сироватки крові дослідних тварин та птиці, інтерпретація результатів проводились спільно із завідувачем кафедри терапії та клінічної діагностики Білоцерківського ДАУ, академіком УААН В.І. Левченком, аспірантами П.В. Шарандаком та А.Ю. Мельником. Гістологічні дослідження проводились за консультативної підтримки співробітників кафедри патанатомії доцентів М.В. Утеченка, І.В. Папченка та М.Є. Іваницького, за що автор висловлює їм щиру подяку.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Мікобіота зерна ячменю

Мікологічним дослідженням встановлено, що кількість КУО в одному грамі зерна урожаю 2003 та 2004 рр. по Україні коливалась від 7,5х10² до 2,1х10⁴ і в середньому становила 6,6х10³±1,2х10³ (табл.1). Більш інтенсивно було контаміноване зерно ячменю у 2003 р., ніж у 2004 р. У зерні зони Степу встановлена найбільша кількість КУО, а у лісостеповій зоні – найменша.

Мікобіота зерна ячменю представлена мікроміцетами 16-ти родів, які віднесені до 27-ми видів та 6-ти різновидів. Протягом двох років домінували гриби родів Aspergillus та Alte aria, а серед аспергілів переважали види A. flavus Lk: Fr. та A. fumigatus Fres., причому контамінація зерна ячменю грибом A. flavus в АР Крим протягом двох років становила 100%. A. niger van Tiegh. протягом двох років був частим контамінантом, а види A. candidus Zk:Fr., A. flavipes (Bain.et Sart.) Thom. et Church., A. ochraceus Wilhelm та A. terreus Thom були рідкісними − контамінація ними зерна складала 2–7%.